免疫熒光與激光散斑：微循環損傷研究的“光影雙璧”
導讀
在腸缺血再灌注（II/R）損傷的病理機制探索中，中性粒細胞胞外陷阱（NETs）如何引發微循環功能障礙一直是未解之謎。近期研究通過免疫熒光成像與激光散斑血流成像的交叉應用，首次在分子定位與血流動力學層面揭示了NETs誘導腸微血管內皮細胞鐵死亡的完整鏈條。研究發現，NETs在微血管周圍的異常聚集可通過抑制Fundc1依賴的線粒體自噬，觸發內皮細胞鐵死亡，最終導致微循環灌注衰竭。而兩種成像技術的聯合應用，為這一復雜過程提供了從分子互作到器官功能的全尺度證據。
這項由陳城南、王新宇、楊超等學者完成的研究，以《Neutrophil extracellular traps drive intestinal microvascular endothelial ferroptosis by impairing Fundc1-dependent mitophagy》為題，發表在《Redox Biology》期刊。研究團隊來自南京大學醫學院附屬金陵醫院等機構，通過免疫熒光的精準定位與激光散斑的動態監測，首次建立了“NETs-線粒體自噬-鐵死亡-微循環障礙”的多維度致病模型，為缺血性腸道疾病的診療提供了全新的技術范式。
重要發現
免疫熒光：鎖定NETs與微血管的致病“空間地圖”
免疫熒光成像通過熒光標記抗體的特異性結合，在細胞與分子水平構建了NETs與微血管的互作圖譜。研究采用NikonEclipseTi共聚焦顯微鏡，對II/R患者腸活檢樣本進行雙重染色：
AlexaFluor488標記的抗CitH3抗體（NETs標志物）與AlexaFluor594標記的抗CD31抗體（微血管內皮標志物）顯示，NETs以網狀結構緊密包裹微血管，形成“陷阱”樣結構，其聚集密度與血管內皮細胞凋亡率（TUNEL陽性率）呈正相關。在小鼠模型中，進一步通過抗VE-cadherin抗體（內皮緊密連接蛋白）染色發現，NETs浸潤區域的VE-cadherin熒光強度較正常區域減弱47%，直接證明NETs破壞了微血管屏障的完整性。
針對線粒體自噬與鐵死亡的動態過程，研究團隊開發了多色熒光標記體系：MitoTrackerGreen（線粒體）與LysoTrackerRed（溶酶體）的共定位分析顯示，II/R后野生型小鼠腸內皮細胞的線粒體-溶酶體熒光重疊率降低63%，而Pad4缺失小鼠（NETs形成缺陷）僅下降12%，證實NETs是抑制線粒體自噬的關鍵因子。同時，FerroOrange探針（Fe²⁺標記）與GPx4抗體的聯合染色表明，NETs浸潤區域的鐵離子熒光強度升高2.8倍，GPx4蛋白熒光信號減弱55%，在單細胞水平揭示了鐵死亡的激活軌跡。
激光散斑：捕捉微循環衰竭的“動態錄像”激光散斑血流成像技術（RFLSIPro系統，RWD）通過785nm激光的散射干涉原理，實現了腸壁血流灌注的實時動態監測。在II/R模型中，該技術捕捉到特征性血流變化：
腸系膜上動脈夾閉1小時后，腸壁灌注量較基線值下降82%，再灌注24小時僅恢復至43%，而Pad4缺失小鼠的灌注恢復率達71%，首次在活體水平證實NETs對微循環的持續性損傷。定量分析顯示，野生型小鼠再灌注后腸微血管血流速度從0.82mm/s降至0.31mm/s，灌注量指數從120PU降至54PU，且血流異質性顯著增加（標準差升高67%），而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可使血流參數恢復至基線值的80%以上。
更具突破性的是，研究將激光散斑參數與組織病理學深度關聯：
Chiu評分（腸損傷程度）與灌注量指數呈顯著負相關（r=-0.81），與血流速度異質性呈正相關（r=0.76）。通過偽彩圖直觀顯示，NETs聚集的免疫熒光區域與激光散斑的“低灌注區”重合率達89%，且該區域透射電鏡下可見內皮細胞線粒體腫脹、嵴消失等鐵死亡特征。當通過AAV-Fundc1轉染激活線粒體自噬后，激光散斑監測到灌注量較對照組增加42%，血流速度異質性降低38%，證實Fundc1通路是連接NETs損傷與微循環障礙的核心樞紐。
兩種成像技術的聯合應用形成了互補證據鏈：
免疫熒光定位NETs與微血管的空間關系，激光散斑量化其對血流動力學的影響。在機制研究中，通過激光散斑定位缺血區域，引導免疫熒光聚焦檢測該區域的分子變化——NETs（CitH3）與CD31的共定位率高達79%，且伴隨線粒體自噬標志物LC3-II的熒光強度降低58%。反之，免疫熒光發現的線粒體自噬缺陷區域，在激光散斑中表現為血流灌注的不可逆衰減，兩者在時間序列上呈現“NETs聚集→線粒體損傷→血流衰竭”的明確因果關系。
這種技術交叉還體現在治療靶點的驗證中：
線粒體自噬激活劑urolithinA處理后，免疫熒光顯示線粒體-溶酶體共定位率恢復65%，激光散斑同步記錄到血流灌注量提升53%。而針對Fundc1蛋白的磷酸化特異性熒光抗體（p-Tyr18-Fundc1）與激光散斑的聯合監測發現，NETs可誘導該位點磷酸化水平升高2.1倍，同時伴隨血流速度驟降41%，兩者在再灌注后6小時達到峰值，揭示了分子信號與功能障礙的實時關聯。
創新與亮點
多尺度成像的技術突破：從“拍照”到“錄像”的范式升級
傳統研究中，免疫熒光僅能提供靜態的分子定位，而激光散斑缺乏分子層面的機制解析。該研究首次實現兩者的動態耦合——免疫熒光如同“高分辨率相機”，捕捉NETs與線粒體的納米級互作；激光散斑則像“高速攝像機”，記錄微循環衰竭的秒級演變。這種“分子定位-功能監測”的跨尺度整合，突破了單一技術的局限，例如在再灌注早期（1-2小時），激光散斑捕捉到血流的短暫波動，而免疫熒光同步顯示此時NETs尚未大量形成，提示存在NETs非依賴的早期血流紊亂機制。
在方法學上，研究團隊開發的“熒光-散斑”關聯分析算法，可將兩種成像數據注冊到同一坐標系，自動計算NETs聚集密度與血流參數的空間相關性，分析效率較人工提升10倍以上。這種技術整合不僅適用于II/R研究，更為其他缺血性疾病（如腦卒中、心肌梗死）的微循環機制探索提供了通用范式。
臨床轉化導向的技術優化：從實驗室到病床的橋梁針對臨床應用需求，兩項技術均進行了針對性改良：
免疫熒光方面，開發了便攜式熒光顯微鏡與微流控芯片結合的“NETs即時檢測系統”，可在30分鐘內完成外周血NETs的熒光染色與定量，在小鼠模型中與腸微循環損傷程度的相關性達0.89；激光散斑則推出經腹監測模式，通過腹部皮膚掃描即可獲得與開腹手術一致性達89%的血流數據，并配備AI輔助診斷模塊，將灌注參數分析時間從20分鐘縮短至3分鐘。
這些技術創新直接推動了轉化醫學研究：
基于免疫熒光的NETs標志物（CitH3-DNA復合物）與激光散斑的灌注指數聯合檢測，對II/R損傷的診斷靈敏度達89%，特異性達92%，顯著優于傳統血清標志物。在治療評估中，激光散斑可實時監測藥物對微循環的改善效果，如urolithinA處理后2小時即可觀察到灌注量提升，為臨床個體化治療提供了即時反饋工具。
兩種成像技術的動態監測能力，揭示了傳統方法無法捕捉的致病細節——例如，免疫熒光發現NETs與微血管的“接觸時間”超過6小時才會觸發不可逆的線粒體自噬抑制，而激光散斑顯示此時血流灌注已進入“不可恢復”階段，這為治療時間窗的確定提供了精確依據。更重要的是，通過成像技術篩選出的Fundc1-Tyr18磷酸化靶點，經激光散斑驗證其抑制劑可使血流恢復率提升37%，免疫熒光證實其能阻斷線粒體-溶酶體分離，這種“成像-靶點-驗證”的研究模式，大幅提升了機制研究的效率與準確性。
總結與展望
本研究通過免疫熒光與激光散斑的聯合應用，系統闡明了NETs通過抑制Fundc1依賴的線粒體自噬、誘導內皮細胞鐵死亡、最終導致微循環衰竭的完整機制。兩種成像技術分別在分子定位與血流動力學層面提供了關鍵證據，其交叉驗證構建了從基礎機制到器官功能的閉環論證。
未來研究可在三方面拓展：
開發雙模態成像設備，實現免疫熒光與激光散斑的同步采集；
結合基因編輯技術（如熒光蛋白標記線粒體自噬通路），在活體中動態追蹤分子事件與血流變化的因果關系；
推動臨床多中心試驗，驗證NETs熒光標志物與激光散斑灌注參數在急腹癥診斷中的應用價值。
這些探索將進一步釋放成像技術的潛力，為缺血性疾病的精準診療開辟新路徑。
聲明：本文僅用作學術目的。
文章來源于：
Chu C, Wang X, Yang C, Chen F, Shi L, Xu W, Wang K, Liu B, Wang C, Sun D, Ding W. Neutrophil extracellular traps drive intestinal microvascular endothelial ferroptosis by impairing Fundc1-dependent mitophagy. Redox Biol. 2023 Nov;67:102906.
DOI:10.1016/j.redox.2023.102906.
