Plant Physiol | DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合助力揭示黃瓜皮色調(diào)控新機(jī)制
研究背景
黃瓜不僅為全球十大蔬菜之一，也是中國重要的蔬菜作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。果皮顏色是黃瓜品質(zhì)性狀的重要標(biāo)準(zhǔn)，它能夠大大影響消費(fèi)者的選擇，具有重要的商品價(jià)值。果皮的顏色主要取決于色素的含量和形成，其中葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮化合物等的含量是影響果皮顏色的主要因素。目前雖已鑒定出多個(gè)調(diào)控果皮顏色的基因，但其參與顏色調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確。
文獻(xiàn)解讀
2025年6月，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)任華中/劉興旺團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology發(fā)表了題為“The transcription factor CsAPRR2 controls peel color by regulating the expression of SULFURTRANSFERASE14 in cucumber”的研究論文。本研究借助RNA-seq技術(shù)成功挖掘到控制黃瓜商品瓜皮色黃化的關(guān)鍵基因CsAPRR2，同時(shí)利用DAP-seq聯(lián)合RNA-seq分析解析了其在全基因組水平的DNA結(jié)合位點(diǎn)，揭示其調(diào)控黃瓜皮色的分子機(jī)制，為深入理解植物果實(shí)皮色形成的分子基礎(chǔ)提供了新的視角，同時(shí)也為利用基因編輯技術(shù)調(diào)控黃瓜果實(shí)外觀品質(zhì)提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
研究團(tuán)隊(duì)通過多代自交培育出僅皮色不同的近等基因系6101-11（黃皮）和6101-12（綠皮）。表型分析顯示，兩者從開花當(dāng)天起葉綠素含量出現(xiàn)顯著差異；電鏡觀察表明，6101-11因葉綠體發(fā)育異常導(dǎo)致葉綠素合成減少而呈黃色。遺傳分析證實(shí)黃皮為單基因隱性性狀，通過BSA-seq分析，在3號染色體末端定位到2.73Mb區(qū)間，再經(jīng)Indel標(biāo)記篩選將目標(biāo)基因縮至198.7kb區(qū)域。結(jié)合RNA-seq分析，從3959個(gè)差異基因中篩選出5個(gè)候選基因，其中Csa3G904140（CsAPRR2）因單堿基插入導(dǎo)致C端缺失101個(gè)氨基酸、丟失Golden2-Like結(jié)構(gòu)域，且與甜瓜皮色調(diào)控基因CmAPRR2親緣關(guān)系近，確定其為調(diào)控黃瓜皮色的候選基因。
圖1. 黃皮突變體的表型特征。
圖2. 基于圖譜克隆的CsAPRR2基因。
圖2. 基于圖譜克隆的CsAPRR2基因。
研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)在CsAPRR2第10、11外顯子設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，獲得三個(gè)純合突變株，其Golden2-Like結(jié)構(gòu)域缺失。突變體表現(xiàn)出果皮、莖稈和葉柄黃化，葉綠素含量降低，葉綠體體積縮小、膜結(jié)構(gòu)模糊、基粒異常且無淀粉顆粒等表型，雖然葉綠體數(shù)量不變，但營養(yǎng)物質(zhì)含量下降，證實(shí)CsAPRR2是黃皮核心基因。亞細(xì)胞定位顯示，CsAPRR2定位于細(xì)胞核，突變后出現(xiàn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和葉綠體。酵母實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶系統(tǒng)證實(shí)其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，突變體活性減弱。
圖3. CsAPRR2基因在黃瓜中的功能驗(yàn)證。
圖4. CsAPRR2的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性。
圖4. CsAPRR2的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性。
為深入解析CsAPRR2介導(dǎo)的果皮黃化分子機(jī)制，作者通過RNA-seq分析，篩選到5146個(gè)差異基因，GO富集分析顯示這些基因主要富集于葉綠體等組分及光合作用相關(guān)過程；WGCNA分析篩選出與皮色正相關(guān)的綠色模塊，并得到113個(gè)核心網(wǎng)絡(luò)基因。通過DAP-seq分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合峰值主要富集于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上下游2kb區(qū)域，最顯著結(jié)合基序?yàn)?/strong>ATCGTTTAGATTTGG。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出103個(gè)共同基因作為直接靶基因，GO富集分析顯示這些基因顯著富集于葉綠體、類囊體等細(xì)胞組分。經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)csaprr2突變體中6個(gè)葉綠體相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中Csa3G238120（CsSTR14）因在突變體中表達(dá)差異顯著、參與硫代謝及鐵硫簇組裝，且存在于WGCNA綠色模塊，被確定為CsAPRR2的直接靶基因。進(jìn)一步通過酵母單雜交、雙熒光素酶報(bào)告基因、EMSA實(shí)驗(yàn)及表達(dá)模式與亞細(xì)胞定位分析，證實(shí)CsAPRR2能特異性結(jié)合CsSTR14啟動(dòng)子的E1元件并激活其表達(dá)。在突變植株中，csaprr2的轉(zhuǎn)錄激活能力降低，盡管結(jié)合位點(diǎn)沒有變化，但突變后的APRR2對CsSTR14啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合親和力顯著減弱，導(dǎo)致CsSTR14表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響了黃瓜果皮中硫的運(yùn)輸，最終影響葉綠體結(jié)構(gòu)的發(fā)育，造成果皮黃化。這一發(fā)現(xiàn)不僅為深入理解果皮顏色形成的分子機(jī)制提供了新的視角，同時(shí)為硫代謝調(diào)控葉綠體發(fā)育的研究拓展了新的方向。
圖5. 黃瓜CsAPRR2結(jié)合基因的全基因組分析。
圖6. CsAPRR2直接結(jié)合CsSTR14并激活其表達(dá)。
圖7. CsAPRR2通過調(diào)控黃瓜中CsSTR14基因的表達(dá)來影響黃瓜果皮顏色。
圖6. CsAPRR2直接結(jié)合CsSTR14并激活其表達(dá)。
圖7. CsAPRR2通過調(diào)控黃瓜中CsSTR14基因的表達(dá)來影響黃瓜果皮顏色。
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