本文原創：生物奇跡 本文來源：細胞基因研究圈

CRISPR - Cas9 系統概述

CRISPR - Cas9 是一種源自細菌免疫系統的基因編輯技術。CRISPR（成簇規律間隔短回文重復序列）是細菌基因組中的一段特殊 DNA 序列，Cas9 是一種能夠切割 DNA 雙鏈的核酸內切酶。在基因編輯過程中，引導 RNA（gRNA）將 Cas9 引導至目標 DNA 序列位置，隨后 Cas9 對目標 DNA 進行切割。

1.敲入（Knock - in）概念

基因敲入是一種將外源基因或經過修飾的基因序列精準插入基因組特定位置的技術。與基因敲除（Knock - out）不同，基因敲入的目的是在基因組中添加或改變基因信息。

2.CRISPR - Cas9 敲入的原理

首先，需要精心設計合適的 gRNA。gRNA 具有特異性識別并結合到基因組中目標敲入位點附近 DNA 序列的能力。在 gRNA 的引導作用下，Cas9 蛋白會在目標位點對 DNA 雙鏈進行切割，從而產生 DNA 雙鏈斷裂（DSB）。

當細胞內出現 DSB 時，細胞會啟動自身的 DNA 損傷修復機制，而該機制主要包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR）這兩種途徑。在基因敲入的過程中，主要借助的是 HDR 途徑。

與此同時，向細胞中提供含有目的基因序列的供體 DNA 模板，該模板的兩端設計有與 DSB 位點兩側具有同源性的序列。在 HDR 過程中，細胞會以供體 DNA 模板作為參考，將目的基因序列精準地整合到基因組的切割位點處，進而成功實現基因敲入。

圖1. 基因敲入原理圖

3.CRISPR - Cas9 敲入的步驟

設計 gRNA 和供體 DNA 模板

為了確保基因編輯的精準性，gRNA 的設計必須具備高度的特異性，從而能夠精確地引導 Cas9 蛋白到達目標位點。借助生物信息學工具，可以高效地篩選出合適的 gRNA 序列，以最大限度地降低脫靶效應的發生概率。在供體 DNA 模板的設計方面，需要包含目的基因以及與目標位點兩側具有同源性的序列。通常情況下，同源臂的長度大致在幾百個堿基對的范圍內，然而，其具體長度還需依據實驗的具體需求、細胞類型以及其他相關因素來綜合確定。

構建 CRISPR - Cas9 敲入載體系統

將 Cas9 蛋白編碼基因和 gRNA 序列整合到適合的載體中，例如質粒載體。與此同時，供體 DNA 模板可以構建到另一個獨立的載體中，或者通過其他方法（如寡核苷酸等）引入細胞中。

細胞轉染或其他導入方式

將構建完成的CRISPR-Cas9載體系統及供體DNA模板導入目標細胞。常用的導入方法包括脂質體轉染和電穿孔等。不同細胞類型對導入方法的敏感性各異，因此需根據具體細胞類型選擇適宜的導入手段，以提升導入效率。

篩選和鑒定敲入細胞

若載體攜帶篩選標記基因，可借助抗生素篩選標記來富集可能發生基因敲入的細胞群體；此外，熒光標記等其他篩選手段亦可用于此目的。隨后，運用PCR、Southern雜交、測序等技術對篩選出的細胞進行鑒定分析，以確認目的基因是否精準地整合至預定的基因組位點。

4.應用領域

生物醫學研究

在疾病模型構建方面，例如在細胞或動物模型中敲入與疾病相關的基因突變，可用于研究疾病的發病機制。以小鼠模型為例，通過敲入人類致病基因，能夠模擬人類遺傳性疾病的發病過程，從而為藥物研發和治療方案的探索提供重要的基礎。

基因治療

該技術有望應用于單基因遺傳病的治療。例如，通過將正常基因精準敲入患者細胞基因組，可糾正致病基因的缺陷。然而，基因治療在臨床應用中仍面臨諸多挑戰，如安全性、免疫反應等問題。

農業育種

該技術可用于農作物品種改良。例如，通過敲入抗蟲、抗病、抗逆等基因，可提升農作物的產量和品質。