白細胞介素-2（IL-2）的發現歷程

· 1974 年：IL-2 被發現。當時，科學家們在研究 T 細胞的生長和分化過程中，觀察到一種能夠促進 T 細胞增殖的因子存在于 T 細胞培養上清液中，但尚未對其進行純化和深入研究。

· 1976 年：NCI 腫瘤細胞生物學實驗室的 Robert Gallo 使用 PHA 刺激淋巴細胞產生條件培養基培養骨髓細胞，發現其中未被純化的成分可維持 T 細胞長達 9 個月的生存，這個成分被稱之為 T 細胞生長因子（TCGF），這是 IL-2 研究的重要進展。

· 1980 年：Robert Gallo 通過離子交換色譜和凝膠分離，從條件培養基中分離濃縮了 TCGF，并得出了大致的分子量約 15kd，這使得 IL-2 的研究向前邁進了一大步。

· 1983 年：

· 日本癌癥研究基金會腫瘤研究中心的 Junji Hamuro 等人克隆了 IL-2 的基因，并完成了測序工作，人們由此可以完整地了解這個 T 細胞生長因子的基因和氨基酸序列等基礎信息。

· 多個實驗室進行了 IL-2 的大腸桿菌表達，這為 IL-2 的進一步研究和應用奠定了基礎。

· 1984 年：Nature 發表了三篇關于 IL-2 受體 α 克隆的文章，分別來自于 Immunex 公司（2002 年被 Amgen 收購）、NCI 和日本京都大學，這標志著對 IL-2 作用機制的研究取得了重要突破，開始深入到受體層面。

· 1985 年：

· Rosenberg 等在新英格蘭醫學雜志報道，使用 IL-2 和 LAK 細胞進行了 25 個癌癥轉移病人的臨床研究，顯示出 IL-2 在腫瘤治療方面的潛在應用價值。

· Rosenberg 在肝癌轉移小鼠模型注射重組 IL-2，獲得了很好的治療效果。

· 1986 年：

· NIH 國立兒童健康與人類發育研究所發現了 IL-2 另外一個受體 p70，1986 和 1987 年還有多篇文章報道 IL-2 p70 受體，進一步豐富了對 IL-2 受體的認識。

· 科學家們發現 T 細胞的激活需要來自 TCR 和 CD28 的信號，此后 CD28 被命名為 “共刺激分子”。

· 1990 年：日本東北大學醫學院和京都大學分別發表文章發現 IL-2Rγ，至此，IL-2 受體 α、β、γ 被全部發現。

· 1991 年：諾華與 Linigen 聯合研發的重組 IL-2 藥物 Proleukin（aldesleukin，阿地白介素）被 FDA 批準治療轉移性腎癌，1998 年批準治療轉移性黑色素瘤。

· 1992 年：IL-2 獲得批準并成為第一個免疫療法。

IL-2 的發現為免疫學和腫瘤免疫治療等領域的發展奠定了重要基礎，后續圍繞 IL-2 及其受體的研究不斷深入，推動了相關疾病治療方法的探索和發展。

IL-2的生物學特性

白細胞介素 - 2（IL-2）的生物學特性主要包括以下幾個方面：

一、產生細胞及誘導因素

· IL-2 主要由活化的 T 淋巴細胞產生，尤其是 CD4+T 細胞和 CD8+T 細胞。當 T 細胞受到抗原、有絲分裂原（如植物血凝素、刀豆蛋白 A 等）等刺激后，便開始合成和分泌 IL-2。此外，自然殺傷（NK）細胞在一定條件下也能產生少量的 IL-2。

二、分子結構與理化性質

· IL-2 是一種分子量約為 15-20 kDa 的糖蛋白，其蛋白結構包含多個重要的功能區域：

· 含有多個半胱氨酸殘基，形成分子內的二硫鍵，對于維持其空間結構和生物學活性至關重要。

· 具有特定的氨基酸序列，這些序列決定了其與受體的結合能力以及生物學功能的發揮。

· 在溶液中，IL-2 表現出一定的溶解性和穩定性特點，在適宜的 pH 值和離子強度條件下能夠保持其活性。

三、受體結合及信號轉導

· 1. IL-2 受體組成

· IL-2 受體是一個由多條多肽鏈組成的復合體，包括 α 鏈（CD25）、β 鏈（CD122）和 γ 鏈（CD132）：

· α 鏈：也稱為 T 細胞活化蛋白 p55，相對分子質量為 55 kDa，是低親和力受體的主要組成部分。單獨的 α 鏈與 IL-2 的結合親和力較低，但在調節受體的表達和功能方面起著重要作用。

· β 鏈：相對分子質量約為 75 kDa，與 IL-2 結合后可以增加受體對 IL-2 的親和力，并且在信號轉導過程中起著關鍵作用。

· γ 鏈：相對分子質量約為 64 kDa，是多種細胞因子受體共用的信號轉導亞單位，對于 IL-2 介導的信號傳遞至細胞內起著不可或缺的作用。

· 不同細胞表面 IL-2 受體的組成和表達水平有所差異，例如活化的 T 細胞和 B 細胞表面高表達 IL-2 受體的三聚體形式（αβγ），具有高親和力；而靜止的 T 細胞和 NK 細胞表面主要表達由 β 鏈和 γ 鏈組成的二聚體受體，親和力相對較低。

· 2. 結合特性與親和力

· IL-2 與受體的結合具有特異性和可飽和性。其結合親和力受到受體組成、細胞活化狀態以及其他因素的影響：

· 當 IL-2 受體以三聚體形式存在時，與 IL-2 的結合親和力高，解離常數（Kd）可達 10-11mol/L 級別；而二聚體受體與 IL-2 的結合親和力相對較低，Kd 約在 10-8mol/L 至 10-9mol/L 之間。

· 3. 信號轉導途徑

· IL-2 與受體結合后，通過激活一系列細胞內信號轉導通路，將信號傳遞至細胞核內，調節基因的表達，從而發揮其生物學效應：

· JAK-STAT 途徑：這是 IL-2 信號轉導的主要途徑之一。IL-2 受體的 β 鏈和 γ 鏈胞內區與 Janus 激酶（JAK）家族成員（如 JAK1、JAK3）相結合。當 IL-2 與受體結合后，JAK 激酶被激活，進而磷酸化信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT）家族成員，特別是 STAT5。磷酸化的 STAT5 形成二聚體，轉移至細胞核內，與特定的 DNA 序列結合，調節一系列與細胞增殖、分化和存活相關基因的表達。

· PI3K-AKT 途徑：IL-2 受體激活后，還可以通過 PI3K（磷脂酰肌醇 3 - 激酶）介導的信號通路調節細胞的代謝和存活。PI3K 被激活后，產生第二信使 PIP3（磷脂酰肌醇 - 3,4,5 - 三磷酸），進而激活 AKT（蛋白激酶 B）等下游分子。AKT 可以調節多種細胞功能，如促進細胞存活、代謝調節以及蛋白質合成等。

· RAS-MAPK 途徑：IL-2 也可以激活 RAS（一種小 G 蛋白），進而啟動 MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）級聯反應。MAPK 信號通路參與調節細胞的增殖、分化和應激反應等多種生物學過程。通過激活 ERK（細胞外信號調節激酶）、JNK（c-Jun 氨基末端激酶）和 p38 等 MAPK 家族成員，將信號傳遞至細胞核內，調節相關基因的表達。

· 這些生物學特性使得 IL-2 在免疫系統中發揮著關鍵的調節作用，參與了免疫細胞的增殖、分化和功能調節等重要生理過程。

IL-2生物制藥方面的應用

· 1. 治療癌癥：

· 刺激免疫細胞活性：IL-2 能促進 T 細胞的增殖和分化，維持 T 細胞活性，刺激 NK 細胞的生成、增殖和活化，并誘導細胞毒性 T 淋巴細胞的生成，誘導和激活淋巴因子激活的殺傷細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞，這些免疫細胞可以攻擊和殺死癌細胞。

· 聯合治療：與其他抗癌藥物如 PD-1 抑制劑聯合使用。例如信達生物的 PD-1/IL-2 雙抗（IBI363），通過激活和擴展類似效應 CD8+T 和 NK 細胞等免疫因子，使 “冷腫瘤” 轉變為 “熱腫瘤”，增強對 PD-1 抗性腫瘤細胞的殺傷；還有君實生物通過授權獲得的 IL-2 系列產品，可與 PD-1 單抗聯合，有利于 PD-1 單抗市場下一階段的競爭。

· 2. 治療自身免疫性疾病：

· 調節免疫平衡：IL-2 對免疫系統有調節作用，可通過調節 T 細胞和調節性 T 細胞（Treg 細胞）的功能來抑制過度活躍的免疫反應。研究發現，針對 IL-2 的不同單克隆抗體可以促進小鼠中不同類型的 T 細胞擴增，某些抗體與 IL-2 結合使用可有效治療自身免疫性疾病和炎癥，目前有一種類似的人單克隆抗體正往臨床試驗發展。

· 靶向特定細胞類型：利用工程化的 IL-2 生物制劑，選擇性地靶向 Treg 細胞，以對抗自身免疫和炎癥性疾病中失調的免疫系統。例如一些 IL-2 類似物通過改變 IL-2 與其受體的結合特性，使其更特異性地作用于 Treg 細胞，從而減輕自身免疫反應。

· 3. 增強疫苗效果：

· 作為疫苗佐劑，增強機體對疫苗的免疫應答。例如在新城疫活疫苗基因組中引入分子佐劑雞 IL2，能夠在疫苗免疫早期刺激雞體內產生 NDV 抗體并增強體液免疫水平，提升免疫保護效率。

IL-2的局限性和解決方案

· 1. 局限性：

· 半衰期短：天然 IL-2 的半衰期很短（通常小于 15 分鐘），這導致在治療過程中需要頻繁給藥，增加了患者的負擔和治療成本，且可能影響患者的依從性。

· 毒性問題：使用高劑量 IL-2 治療癌癥時，會引起嚴重的非特異性毒性，可能出現如低血壓、急性腎功能衰竭等嚴重的并發癥，還可能有發熱、畏寒、疲乏感、惡心嘔吐等常見副作用，對患者的身體造成較大負擔，甚至可能危及生命。

· 免疫調節復雜性：IL-2 雖然可以激活免疫細胞發揮抗腫瘤等作用，但它同時也能激活 Treg 細胞，而腫瘤微環境中的 Treg 細胞通常起到免疫抑制的作用，可能會抵消 IL-2 激發的抗癌免疫反應，影響治療效果。

· 藥代動力學特性欠佳：藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄過程不夠理想，可能導致藥物在體內的濃度不穩定，影響療效的發揮，且可能增加藥物的副作用。

· 2. 解決方案：

· 工程化改造 IL-2：IL-2 突變體：通過引入基因突變，改變 IL-2 蛋白表面的特定氨基酸，生成傾向與高親和力受體或中親和力受體結合的 IL-2 突變體。例如安進公司的 efavaleukin alfa，將攜帶特定突變的 IL-2 與抗體的 Fc 端融合在一起，構成的融合蛋白不但具有更長的半衰期，而且傾向與高親和力受體相結合，能夠促進 Treg 細胞的增生，從而恢復自身免疫疾病患者的免疫平衡。

· 聚乙二醇修飾的 IL-2：將聚乙二醇（PEG）偶聯在 IL-2 蛋白表面可以延長 IL-2 蛋白的半衰期。通過控制聚乙二醇在 IL-2 表面偶聯的位置和數量，可以構建出傾向與高親和力受體或者中親和力受體結合的 IL-2 類似物。如 Nektar Therapeutics 公司開發的 bempegaldesleukin（NKTR-214），通過在 IL-2 與 CD25 結合的界面附近平均偶聯 6 個 PEG 鏈，阻斷了它與高親和力 IL-2R 受體的結合，更傾向于激活 CD8 陽性記憶 T 細胞和 NK 細胞。為解決部分 PEG 修飾的 IL-2 存在的 PEG 修飾位點不一致的問題，有些生物技術公司在 IL-2 表面引入非天然氨基酸，將 PEG 鏈偶聯在這些非天然氨基酸上，以生成同質化更強的 IL-2 類似物，如賽諾菲公司的 SAR444245。

· IL-2 免疫復合體：IL-2 與抗 IL-2 單抗結合構成復合體，既可以延長 IL-2 蛋白半衰期，又能調節 IL-2 的受體結合選擇性。例如 Anaveon 公司開發的選擇性 IL-2R 激動劑 ANV419。

· 聯合用藥：將 IL-2 與其他藥物聯合使用，以提高療效或減輕副作用。比如與 PD-1 抑制劑等免疫檢查點抑制劑聯合應用，增強抗腫瘤效果；或與其他具有協同作用的藥物聯合，改善患者的免疫狀態。

· 優化給藥方式：探索更合適的給藥途徑和方案，如采用緩釋制劑、局部給藥等方式，減少藥物的全身暴露，降低副作用，同時提高藥物在局部的濃度和作用時間。

· 精準醫療策略：根據患者的個體差異，如基因表達譜、免疫狀態等，制定個性化的治療方案，選擇適合患者的 IL-2 制劑、劑量和給藥方式，以提高治療效果并減少不良反應。

· 開發新型藥物：研究和開發具有類似 IL-2 功能但克服其局限性的新型藥物，或者利用基因編輯等技術對 IL-2 的作用機制進行深入研究和改造，以創造出更高效、安全的治療藥物。

IL-2工程化改造方案

一、蛋白質工程改造

· 1. 突變體設計

· 改變受體結合特性：

· 通過對 IL-2 蛋白關鍵氨基酸位點進行定點突變，可以改變其與不同受體亞基的結合親和力。例如，將某些關鍵位點的氨基酸殘基進行替換，使其更傾向于與高親和力受體（由 αβγ 鏈組成）中的 βγ 鏈結合，這樣可以增強對效應 T 細胞和 NK 細胞的激活作用，同時減少對調節性 T 細胞（Tregs）的過度刺激。

· 設計突變體以降低與 α 鏈（CD25）的結合能力，從而減少對 Tregs 的優先激活，使 IL-2 更多地作用于具有抗腫瘤活性的免疫細胞，增強其在癌癥免疫治療中的效果。

· 增加穩定性：

· 在 IL-2 的結構中引入額外的二硫鍵或對現有的二硫鍵進行優化，以提高蛋白質的熱穩定性和抗蛋白酶降解能力。這可以延長 IL-2 在體內的半衰期，減少給藥頻率。

· 對 IL-2 蛋白表面的氨基酸進行修飾，使其具有更優化的親水性或疏水性分布，改善蛋白質的折疊穩定性和在溶液中的穩定性。

· 2. 融合蛋白構建

· 與抗體片段融合：

· 將 IL-2 與抗體的 Fc 片段融合，形成 IL-2-Fc 融合蛋白。Fc 片段可以延長 IL-2 在體內的半衰期，通過與新生 Fc 受體（FcRn）結合，避免被腎臟快速清除。同時，抗體部分還可以提供靶向特定細胞或組織的功能，例如可以設計針對腫瘤相關抗原的雙特異性抗體，其中一端結合腫瘤抗原，另一端融合 IL-2，實現將 IL-2 精準遞送到腫瘤微環境中，提高局部免疫激活效果，降低全身毒性。

· 利用抗體的可變區片段（scFv）與 IL-2 融合，構建具有靶向特定細胞類型能力的融合蛋白。例如，設計針對特定免疫細胞表面標志物的 scFv-IL-2 融合蛋白，實現對特定免疫細胞群體的選擇性激活。

· 與其他蛋白或多肽融合：

· 將 IL-2 與其他細胞因子或免疫調節蛋白融合，形成具有協同作用的多功能融合蛋白。例如，將 IL-2 與 IL-15 融合，IL-15 也是一種重要的免疫細胞生長因子，兩者融合后可以同時激活多種免疫細胞，增強免疫應答效果。

· 與具有延長半衰期功能的多肽融合，如與白蛋白結合多肽融合，利用白蛋白在體內的長循環特性，延長 IL-2 的作用時間。

二、聚乙二醇化修飾

· 1. 位點選擇和優化：

· 通過化學方法將聚乙二醇（PEG）分子連接到 IL-2 蛋白的特定氨基酸殘基上。選擇合適的位點進行 PEG 修飾至關重要，一般選擇在對 IL-2 生物活性影響較小的表面暴露區域進行修飾。例如，選擇遠離與受體結合關鍵區域的氨基酸位點進行 PEG 偶聯，以盡量減少對 IL-2 與受體結合能力的影響。

· 優化 PEG 的分子量和連接方式（如直鏈 PEG 或支鏈 PEG），以獲得藥代動力學特性和生物活性平衡。較大分子量的 PEG 通常可以提供更長的半衰期，但可能會對生物活性產生更大的影響，因此需要根據具體需求進行優化選擇。

· 2. 控制修飾程度：

· 精確控制 PEG 與 IL-2 的偶聯比例，確保修飾后的產物具有一致的質量和性能。可以通過優化反應條件和純化工藝，實現對 PEG 修飾程度的精確控制。例如，采用特定的化學反應條件和純化方法，使每個 IL-2 分子上連接的 PEG 分子數量保持在一個合理的范圍內，以保證修飾后的 IL-2 具有良好的生物活性和藥代動力學特性。

· 對修飾后的 IL-2 進行質量檢測和分析，確保產品的一致性和穩定性。采用先進的分析技術，如質譜分析、高效液相色譜等，對 PEG 修飾的 IL-2 進行詳細的結構和質量表征，以監控生產過程中的質量變化。

三、構建 IL-2 免疫復合體

1. 與抗體結合形成免疫復合體：

利用特異性抗 IL-2 抗體與 IL-2 結合形成免疫復合體。這種免疫復合體可以改變 IL-2 的生物活性和藥代動力學特性。例如，某些抗 IL-2 抗體可以選擇性地調節 IL-2 與不同受體亞基的結合，從而改變其對免疫細胞的激活模式。

設計具有特定功能的抗 IL-2 抗體，如可以優先促進 IL-2 與效應 T 細胞表面受體結合的抗體，與 IL-2 結合形成免疫復合體后，增強對效應 T 細胞的激活作用，提高抗腫瘤免疫應答。

通過對抗體的結構和親和力進行優化，調節免疫復合體的穩定性和生物活性。例如，改變抗體的可變區序列，提高其與 IL-2 的結合親和力和特異性，以獲得更理想的免疫復合體性能。

2. 利用其他分子構建復合體：

除了抗體，還可以利用其他生物分子或化學分子與 IL-2 構建復合體。例如，使用脂質體、聚合物納米顆粒等載體材料將 IL-2 包裹或吸附在其表面，形成具有特定釋放特性和靶向能力的復合體。這些載體可以保護 IL-2 免受體內酶的降解，延長其作用時間，并可以通過表面修飾實現對特定組織或細胞的靶向遞送。

利用生物相容性聚合物或凝膠材料與 IL-2 結合，形成可注射的緩釋制劑。這些緩釋制劑可以在體內逐漸釋放 IL-2，維持一定的藥物濃度，減少給藥次數，同時提高患者的依從性。

四、基于基因工程的改造

1. 表達載體優化：

設計和構建高效的 IL-2 基因表達載體，用于在生物體內或體外生產 IL-2。優化表達載體的啟動子、增強子和其他調控元件，以提高 IL-2 的表達水平和穩定性。例如，使用強啟動子如 CMV 啟動子或組織特異性啟動子，根據應用場景選擇合適的表達系統，如細菌、酵母、哺乳動物細胞等表達系統，以滿足不同的生產需求和藥物質量要求。

在表達載體中引入融合標簽或信號肽序列，便于 IL-2 的表達、純化和分泌。例如，添加 His 標簽用于后續的蛋白純化，或添加特定的信號肽序列，促進 IL-2 在細胞內的正確折疊和分泌到細胞外。

2. 基因編輯技術應用：

利用基因編輯技術如 CRISPR/Cas9 對 IL-2 基因進行精確修飾，以改變其編碼的蛋白質結構和功能。例如，可以在 IL-2 基因中引入特定的突變，實現對其生物活性、受體結合特性等方面的定制化改造。

通過基因編輯技術在細胞內直接對 IL-2 及其相關信號通路進行調控。例如，在免疫細胞中敲除或敲入與 IL-2 信號傳導相關的基因，以研究其對免疫細胞功能的影響，并為設計更有效的 IL-2 治療策略提供依據。

3. 基因治療策略：

將 IL-2 基因導入患者體內的細胞，實現體內持續表達 IL-2。可以使用病毒載體（如腺病毒、慢病毒等）或非病毒載體（如質粒 DNA、納米顆粒等）將 IL-2 基因遞送到目標細胞中。例如，在腫瘤免疫治療中，將 IL-2 基因導入腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）或其他免疫細胞中，增強其抗腫瘤活性。

利用基因調控元件控制 IL-2 基因的表達時間和水平。例如，使用可誘導的啟動子系統，根據患者的治療需求和病情發展，在特定的時間點或在特定的刺激條件下啟動 IL-2 基因的表達，以實現精準的治療控制，同時減少潛在的副作用。

逐典高活性偏向性IL-2

逐典生物研發團隊具有十多年跨國公司工作經驗，在蛋白分子結構設計方面具有豐富的經驗，曾將多個蛋白新分子藥物推至臨床階段。逐典生物研發團隊憑借專有的蛋白設計平臺，開發出具有偏向性的IL-2，通過改變與α、β和γ三種不同受體的親和力實現優先高效激活CD8+T細胞或者高效優先激活Treg細胞。不論通過展示在免疫細胞表面，抑或是從人體分離相關免疫細胞中使用，偏向型IL-2的使用會更有效地滿足細胞藥物研發需求

下面以逐典生物IL-2 AID為例，展示其優先激活Treg細胞的相關數據（其他更多偏向性細胞因子信息，歡迎聯系技術熱線15951985773）。

圖1. IL-2 AID分子更易使穩定表達有αβγ受體的細胞增殖

圖2. 體外刺激人PBMC結果顯示，IL-2 AID分子可以優先刺激Treg增殖，與IL-2 WT相比，CD8+ T和Treg ED50差值明顯增大