細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用指南及注意事項(xiàng)
檢測原理
用于檢測細(xì)胞凋亡早期的發(fā)生。
PS正常分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期,不同類型的細(xì)胞都會把PS外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。用帶有FITC標(biāo)記的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細(xì)胞膜,但可以穿透壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。因此,將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí),PI被排除在活細(xì)胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)外,而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。
FITC最大吸收波長為490nm,發(fā)射波長為525nm,PI-DNA復(fù)合物的最大吸收和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。
使用方法
01.樣品染色
1. 將Binding buffer(10×)稀釋成1×Binding buffer工作液備用(1 mL Binding buffer(10×)需加入9 mL無菌去離子水)。2. 對于懸浮細(xì)胞, 500-1000×g 離心 5min 收集細(xì)胞。
對于貼壁細(xì)胞, 要用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞, 胰酶消化時(shí)間不宜過長或過短,最好是在輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí),加入細(xì)胞培養(yǎng)液,將細(xì)胞輕輕吹打下來,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi), 500-1000×g離心5min收集細(xì)胞。
3. 收集細(xì)胞后,加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌,離心收集細(xì)胞,共洗滌兩次。
4. 在細(xì)胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重懸細(xì)胞,使細(xì)胞濃度達(dá)到 1×10^6 cell/mL。
5. 吸取100μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)為 1×10^5 cell)至一新管中,加入5μL Annexin V-FITC 和 5-10μL PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15min。
02.樣品檢測
建議設(shè)置正常細(xì)胞、PI單染和 Annexin V-FITC 單染3個(gè)對照組,正常細(xì)胞組可作為熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。若十字門的位置不易設(shè)定,可采用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行設(shè)定。結(jié)果可用CellQuest等軟件進(jìn)行分析,繪制雙色散點(diǎn)圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標(biāo),PI為縱坐標(biāo)。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時(shí),活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光,早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光,晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色雙重?zé)晒狻?br /> 2. 熒光顯微鏡檢測：染色孵育后涂片,顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞,細(xì)胞核顯示紅色,膜上有綠色光環(huán)。
注意事項(xiàng)
1. 可立式離心管內(nèi)試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,避免開蓋時(shí)液體灑落。
2. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物質(zhì),在保存與操作時(shí)請注意避光。
3. 在細(xì)胞洗滌的最后一步,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4. 為獲得準(zhǔn)確試驗(yàn)結(jié)果,建議樣品在染色后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。
5. 為了您的安全和健康,請穿戴實(shí)驗(yàn)防護(hù)服、手套、口罩等必要的防護(hù)裝備。
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