采用聚合酶鏈反應(yīng)等手段在體外獲得成套抗體可變區(qū)輕重鏈基因，將這些基因重組入一定的載體，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞或噬菌體中，這些抗體基因克隆的集合體稱為抗體文庫(kù)。從該文庫(kù)中能夠表達(dá)和篩選出所需的單克隆抗體。

納米抗體文庫(kù)就是將抗體文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中的抗體序列換成了納米抗體的序列，轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞或噬菌體中即可得到相應(yīng)文庫(kù)。

納米抗體文庫(kù)的分類和傳統(tǒng)抗體文庫(kù)的分類一致，都可分為——免疫文庫(kù)，天然文庫(kù)和合成文庫(kù)。下邊我們一一介紹：

免疫納米抗體文庫(kù)就是要用特異的抗原對(duì)駝科動(dòng)物進(jìn)行免疫，通常需要免疫5次，大概需要6-8周，免疫之后取頸靜脈血，分離PBMC/淋巴細(xì)胞提取rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，擴(kuò)增VHH基因序列，將基因序列克隆至噬菌體展示載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌即可獲得免疫文庫(kù)，文庫(kù)庫(kù)容通過(guò)長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)來(lái)確定。之后利用該展示文庫(kù)篩選表達(dá)目的抗體的噬菌體，去除不表達(dá)目的抗體的噬菌體，通過(guò)pcr擴(kuò)增和單克隆測(cè)序來(lái)檢測(cè)文庫(kù)的抗體基因插入率和文庫(kù)多樣性。

圖1 免疫納米抗體文庫(kù)

在一些抗原無(wú)法進(jìn)行免疫的情況下（比如抗原沒(méi)有免疫原性或者抗原含有毒性），天然納米抗體文庫(kù)就比較有優(yōu)勢(shì)了。

天然文庫(kù)不需要制備抗原對(duì)動(dòng)物免疫，僅僅采集年輕健康的駝科動(dòng)物的頸靜脈血分離淋巴細(xì)胞提取RNA或者提取脾臟的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，對(duì)VHH抗體的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將基因片段克隆至嗜菌粒載體上，轉(zhuǎn)化TG1即可獲得天然納米抗體文庫(kù)。因?yàn)槭褂昧耸染�粒載體，所以需要用輔助噬菌體（M13KO7、R408和 VCSM13）進(jìn)行超染，才能使插入的基因展示在噬菌體表面。之后確定庫(kù)容、篩選、鑒定文庫(kù)的抗體基因插入率和文庫(kù)多樣性和之前說(shuō)過(guò)的免疫納米抗體文庫(kù)的方法一致。

圖2 天然納米抗體文庫(kù)

然而為了得到高親和力的抗體，通常需要構(gòu)建一個(gè)庫(kù)容達(dá)到10⁹-10¹⁰文庫(kù)并且其中高于80%的克隆應(yīng)該都可以編碼納米抗體。為了構(gòu)建一個(gè)庫(kù)容較大且文庫(kù)多樣性豐富的天然納米抗體文庫(kù)，需要同時(shí)從不同的駝科動(dòng)物抽取大量頸靜脈血（如果想獲得10¹⁰不同的VHH克隆，大概需要大于10升的血液），這也導(dǎo)致工作量的增加。因此，構(gòu)建多樣性豐富的合成納米抗體庫(kù)是更有意義的。

納米抗體合成庫(kù)的構(gòu)建核心是人為創(chuàng)造出具有多樣性的VHH片段，大致流程如下：

(1) 選擇蛋白框架：與來(lái)自動(dòng)物宿主的每個(gè)納米體都有自己的框架區(qū)域不同，來(lái)自合成納米體庫(kù)的所有納米體都需要共享相同的框架區(qū)域序列。共享的框架需要是穩(wěn)定的、易表達(dá)的、高度通用的。納米抗體合成庫(kù)基本的框架是一致的，一種名為cAbBCII10的天然納米抗體已被測(cè)試為合成納米抗體文庫(kù)框架的良好選擇。

(2) 模板確定；

(3) 通過(guò)引物設(shè)計(jì)在CDR隨機(jī)突變：文庫(kù)的多樣性體現(xiàn)在CDR，要確定突變CDR區(qū)的數(shù)量、每個(gè)CDR區(qū)的長(zhǎng)度。一般CDR3區(qū)是確定親和力和特異性的主要區(qū)域，可以僅對(duì)CDR3區(qū)突變，CDR3區(qū)可設(shè)計(jì)多個(gè)長(zhǎng)度。為了防止插入終止密碼子或者發(fā)生移碼突變，目前通常使用三聯(lián)核苷酸突變技術(shù)來(lái)合成引物。

(4) 合成模板和引物：考慮到合成庫(kù)的有效性，需要保留重要氨基酸位點(diǎn)，比如形成二硫鍵Cys位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物中應(yīng)包含多樣性的CDR區(qū)和重疊延伸時(shí)片段之間的重疊序列。

(5) 采用不對(duì)稱和重疊PCR合成多樣性的VHH片段：合成隨機(jī)引物時(shí)，引物合成公司將在每個(gè)特定的位點(diǎn)添加混合堿基，每一個(gè)混合堿基池都是可以按一定比例定制。對(duì)于不同長(zhǎng)度的CDR區(qū)，可以將每個(gè)長(zhǎng)度制備成一個(gè)混合池，這些池可以在以后以特定的比例進(jìn)一步混合，利用PCR技術(shù)重組VHH片段。

之后的文庫(kù)篩選和驗(yàn)證也和之前講過(guò)兩種文庫(kù)的相一致。

圖3 合成納米抗體文庫(kù)構(gòu)建及驗(yàn)證