一、線性化的目的
載體的主要作用是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，只有當(dāng)載體處于線性化狀態(tài)時才能與外源目的基因完成重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
與原核表達(dá)不同，在酵母表達(dá)中，用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或載體上往往不含有酵母自身的復(fù)制源點，如果將環(huán)狀重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞則不能穩(wěn)定存在，所以必須進(jìn)行線性化處理之后，以同源重組的方式整合到酵母染色體上，這樣目的基因才會在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定存在。
 
二、酵母體系常用載體
酵母載體類型包括酵母克隆載體、酵母表達(dá)載體以及酵母人工染色體(YAC)。
 
（1）酵母克隆載體：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達(dá)外源基因，可分為兩類：
a. 酵母整合型質(zhì)粒(yeast integrated plasmid. Yip): 帶有一個酵母URA3標(biāo)志基因和大腸桿菌的復(fù)制和報告基因。由于質(zhì)粒DNA與酵母基因組DNA之間發(fā)生了同源重組，在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中可以檢測到質(zhì)粒的整合復(fù)制，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。
b. 酵母復(fù)制型質(zhì)粒(Yeast replicable plasmid, Yrp): 該類載體在酵母中可以自我復(fù)制，主要有YRp, YEp和YCp
• 酵母復(fù)制質(zhì)粒(YRp): 細(xì)茵質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標(biāo)記+酵母復(fù)制序列(ARS)，可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差；
• 酵母附加型質(zhì)粒(YEp): 細(xì)菌質(zhì)粒DNA+酵母標(biāo)記基因+酵母2 μM質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制，穩(wěn)定性好。2μm質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)(ori) 和STB區(qū)，STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定；
• 酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp): 該載體除含復(fù)制起點外，還有酵母菌染色體著絲粒(CEN), 因而能在染色體外自我復(fù)制，拷貝數(shù)低但很穩(wěn)定，適合作亞克隆載體和構(gòu)建酵母菌基因組DNA文庫。
YIp: 帶有一個酵母標(biāo)志基因；
YRp: 在YIp的基礎(chǔ)上添加酵母復(fù)制序列(ARS)；
YEp: 在YIp的基礎(chǔ)上添加酵母2μM質(zhì)粒。
 
（2）酵母表達(dá)載體：含酵母啟動子，酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制。
釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中重組蛋白的生產(chǎn)可以使用三種類型的載體完成：整合質(zhì)粒（YIp），附加型質(zhì)粒（YEp）和著絲粒質(zhì)粒（YCp）。在非常規(guī)酵母中，質(zhì)粒選擇受到更多限制。雖然質(zhì)粒可用于三種非常規(guī)酵母，但它們的拷貝數(shù)往往較低，并且易突變。因此，基因組整合仍是首選。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的包括分泌表達(dá)載體和非分泌型表達(dá)載體兩種：
a.畢赤酵母分泌表達(dá)載體
pPICZα A、B 和C 載體用于表達(dá)和分泌畢赤酵母中的重組蛋白，可用于任何畢赤酵母菌株，包括X-33、SMD1168H 和KM71H等。
pPICZα 載體包含以下元素：
• AOX1 啟動子，對相關(guān)基因進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，保證甲醇誘導(dǎo)表達(dá)；
• 用于重組蛋白分泌的α-因子分泌信號；
• Zeocin （博萊霉素）基因用于大腸桿菌和畢赤酵母中的篩選。
•含有c-myc 抗原決定簇和(6xHis) 標(biāo)簽的C 端肽用于檢測和純化重組融合蛋白。
b.畢赤酵母非分泌型表達(dá)載體：
pGAPZ A, B, 和C 載體（2.9 Kb）使用GAP啟動子在畢赤酵母中穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白。GAP啟動子的重組蛋白表達(dá)水平略高于AOX1啟動子。與誘導(dǎo)型啟動子對比，組成型啟動子可以利用更多的碳源在畢赤酵母中表達(dá)外源蛋白。重組蛋白表達(dá)為帶有C端His標(biāo)簽的融合蛋白。Zeocin的篩選標(biāo)記可以同時使用于畢赤酵母和大腸桿菌。
 
（3）酵母人工染色體
酵母人工染色體（YAC），是一種能夠克隆長達(dá)400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細(xì)胞中必需的端粒、著絲點和復(fù)制起始序列，是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體。
特點：容量大（50-1000kb), 穩(wěn)定性差。
作用：用于構(gòu)建基因組文庫。
酵母中復(fù)制的必需元件包括自主復(fù)制序列（ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（CEN）和兩個端粒（TEL）。
• 端粒重復(fù)序列（TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA 不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；
• 著絲粒（CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC 中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒；
• 自主復(fù)制序列（ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號。
在YAC載體中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記。
 
三、酵母系統(tǒng)載體選擇
酵母表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外表達(dá)兩種方式，這取決于表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是否帶有信號肽，可根據(jù)基因表達(dá)的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達(dá)載體。
① 胞內(nèi)表達(dá)載體：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。該類載體將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達(dá)或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達(dá)水平高但純化相對復(fù)雜。
② 分泌到胞外表達(dá)的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由 89 個氨基酸組成α交配因子的引導(dǎo)。
③ 多拷貝插入表達(dá)載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達(dá)量。
 
四、線性化驗證及結(jié)果解讀
線性化酵母前后跑對比電泳。切開后的條帶應(yīng)該跑的慢（4-7），完整質(zhì)粒跑在前面（1-3）。