（超）多重PCR的技術門檻到底高不高，做過PCR的人都明白，做單重PCR都會有二聚體和非特異擴增的存在，更何況一管內擴增幾千重，那二聚體和非特異擴增簡直就是災難級別的，根本看不到目標條帶，二聚體完全掩蓋住了目標條帶擴增。目前，突破多重PCR技術壁壘，基本可以歸納為2個方向：生信設計和實驗改造。

一、生信算法

很多科研團隊開發了很多多重PCR引物的算法和軟件， MultiPLX計算現有PCR引物的相容性評分，并對多重PCR引物進行分組；Oli2go將多個序列作為輸入，為所有序列設計多重引物和探針，其特異性檢查不僅限于單個物種，而且可以在多種物種上進行；MPprimer和PrimerStation設計多重引物組，其擴增子的大小不同，以便通過電泳分離；MCMC-ODPR采用Markov chain Monte Carlo優化方法，圍繞單核苷酸多態性設計多重簡并引物，注重引物的可重復使用性，以降低成本。

引人注目的應該是，Nature Communications上的，一種二聚體似然估計的模擬退火設計（SADDLE）的算法。在大型擴增子法測序panel中實現了超低的引物二聚體水平，研究團隊進一步設計了384-plex panel（768 對引物）進行驗證，優化流程耗時60分鐘，而最終實驗觀察到的引物二聚體比例僅為1%。高通量PCR儀二、實驗優化

實驗優化的邏輯其實很簡單，多重PCR就好比多個魚鉤去釣魚，現在問題出在魚鉤太多，那就對魚鉤進行優化，上面說的生信分析，就是利用生信算法，挑選整個體系中最合適的魚鉤，讓魚鉤彼此之間不會有干擾。而實驗方法，則是改造魚鉤，將魚鉤改造成不容易互相干擾的樣式。一些創新的多重PCR技術方法，采用Ω引物結構，提高引物的特異性，減少非特異性擴增。

或者將魚鉤封住，等到需要它的時候，再讓它發揮功能，比如：IDT的rhAmp PCR技術，

使用帶RNA堿基的rhAmp引物對目標區域進行多重PCR擴增

，RNase H2 對 DNA:RNA 雜合雙鏈內的 RNA 堿基進行靶向切割

解除，3' 端封閉序列從而活化rhAmp 引物

。RNase H2 具有高度特異性，只切割完全互補匹配的RNA堿基，因此減少了非特異性雜交和引物二聚體。

其中，最經典去除二聚體的方法，當然是引物中引入U堿基，擴增后，使用UDG等混酶，消化多余的引物，防止引物二聚體。還有其他很多的技術方法，大部分都是在引物上的修飾或改造。

上面說的技術方法，能夠在一定程度上解決引物二聚體的干擾問題。但是很難徹底解決這個問題。因此多重PCR，依然存在重數限制，達到1000重算是很不錯了。

在技術應用上，利用多重PCR進行病原菌檢測，應該是技術門檻最高的，因為病原菌的含量在患者的組織或體液中有的很低，而且有人源基因組的擴增干擾問題（背景DNA太多），對于多重擴增帶來了很大的問題。引物二聚體的問題更是突出。但是多重PCR技術的便捷和低價，是這個技術優點，因此如果能夠真的將多重PCR技術的諸多問題解決，在許多方面，可以大規模低成本的使用，如分子遺傳育種、突變識別等方面都可以發揮巨大價值。