講解細胞凍存實驗步驟及注意事項
隨著溫度降低，細胞內的酶活性會逐漸降低，到-70℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實現長期保存。然而，隨著溫度降低，細胞內外的水分也會“結冰”并形成冰晶，冰晶能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。
實驗步驟：
1. 保持凍存前細胞狀態良好
凍存前一定要保證細胞狀態良好，細胞處于對數生長期，否則不管后面怎么處理，凍存后的細胞狀態必然有影響。若細胞密度偏高，培養基已經略微變黃，細胞狀態正常，需要換液培養2h以上再凍存細胞；若已*變黃，細胞死亡超過20%，需要傳代后再重新培養至狀態正常后再凍存細胞。
2. 消化、吹打細胞按盡量輕柔
凍存后細胞培養瓶和培養皿肯定還是會殘留一點細胞，這些殘留的細胞加新的培養基繼續培養，如果培養正常就可以看出凍存時消化、吹打操作是沒有問題的，如果直接死了或者狀態不好，那凍存的細胞自然也好不到哪里去，問題出在哪就很明顯了。
3. 凍存液配方要給合適的
凍存液配方這個其實不同實驗室都有自己的習慣，有FBS+10%DMSO的，也有*培養基+10%DMSO的，還有基礎培養基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說是五花八門，但總體來說，DMSO一般是不超過12%的，血清濃度越高凍存效果也越好，因此需要多凍幾次對比合適的配方。
4. 凍存液要提前配置
凍存液使用時要提前配好，不能直接在細胞懸液中加DMSO凍存細胞，否則DMSO溶解時濃度不均加上溶解放熱會損傷細胞活性。可以現配先用，也可以多配一點，4度最多可以保存3個月，-20度可以保存一年。細胞用凍存液重懸后應盡快放到4度或者程序性凍存盒開始凍存，避免長時間室溫狀態，因為室溫條件下DMSO對細胞是有害的。
5. 凍存細胞數量選擇
通常來說，凍存細胞都會有一部分細胞死亡，所以凍存剩下的活細胞數量才是決定細胞復蘇后能否正常養起來的關鍵。一般凍存不容易死的細胞數量每管在100-200萬就夠了，一些凍存很容易死的細胞，比如NK92、THP-1、SF9等細胞數量要稍微高點，300-400萬左右為宜。凍存液一般1ml左右每管，這個基本每個實驗室都差不多。
6. 凍存程序選擇
凍存的時候可以選擇用程序性凍存盒直接放到-80度凍存細胞，但要記得異丙醇要及時更換，一般用4-5次異丙醇含水量就超標了，不再適合凍存細胞使用。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h，-80過夜后液氮保存。-80度不適合細胞長期保存，只能短期保存，最好不要超過一周，否則有部分細胞系活性可能會下降很厲害，長期保存的細胞最好放液氮罐保存。
7. 注意凍存檢查
凍存細胞后應在同一批次內隨機選一只細胞復蘇檢測凍存效果， 如果復蘇效果不佳的話需要找到問題所在摸索合適條件重新凍存細胞，如果復蘇良好的就可以放到液氮里長期保存了。這個也是前面推薦將凍存剩下的細胞繼續培養的原因，可以有效避免細胞凍存失敗導致絕種。
實驗步驟：
1. 制備凍存液，凍存液比例：本實驗室采用70%基礎培養基+20%FBS+10%DMSO，不同實驗室及不同細胞可能略有差異，也可采用55%基礎培養基+40%FBS+5%DMSO；
2. 取形態良好，處于對數生長期的細胞，對其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計數；
3. 根據細胞數量加入對應的凍存液，使細胞密度維持在300-500w/mL；
4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標記。
5. 分裝好的凍存管轉入程序降溫盒后直接放-80℃過夜；
6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜，注意轉移過程中要保冷，避免產生溫差或凍存管融化；
7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮長期保存。
我們都知道，細胞如果要長期保存，需要凍存起來放液氮保存。那怎么樣凍存細胞才能保證細胞能正常復蘇，不至于凍存死亡呢？下面我們就來講解細胞凍存應該注意的一些地方。1. 保持凍存前細胞狀態良好
凍存前一定要保證細胞狀態良好，細胞處于對數生長期，否則不管后面怎么處理，凍存后的細胞狀態必然有影響。若細胞密度偏高，培養基已經略微變黃，細胞狀態正常，需要換液培養2h以上再凍存細胞；若已*變黃，細胞死亡超過20%，需要傳代后再重新培養至狀態正常后再凍存細胞。
2. 消化、吹打細胞按盡量輕柔
凍存后細胞培養瓶和培養皿肯定還是會殘留一點細胞，這些殘留的細胞加新的培養基繼續培養，如果培養正常就可以看出凍存時消化、吹打操作是沒有問題的，如果直接死了或者狀態不好，那凍存的細胞自然也好不到哪里去，問題出在哪就很明顯了。
3. 凍存液配方要給合適的
凍存液配方這個其實不同實驗室都有自己的習慣，有FBS+10%DMSO的，也有*培養基+10%DMSO的，還有基礎培養基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說是五花八門，但總體來說，DMSO一般是不超過12%的，血清濃度越高凍存效果也越好，因此需要多凍幾次對比合適的配方。
4. 凍存液要提前配置
凍存液使用時要提前配好，不能直接在細胞懸液中加DMSO凍存細胞，否則DMSO溶解時濃度不均加上溶解放熱會損傷細胞活性。可以現配先用，也可以多配一點，4度最多可以保存3個月，-20度可以保存一年。細胞用凍存液重懸后應盡快放到4度或者程序性凍存盒開始凍存，避免長時間室溫狀態，因為室溫條件下DMSO對細胞是有害的。
5. 凍存細胞數量選擇
通常來說，凍存細胞都會有一部分細胞死亡，所以凍存剩下的活細胞數量才是決定細胞復蘇后能否正常養起來的關鍵。一般凍存不容易死的細胞數量每管在100-200萬就夠了，一些凍存很容易死的細胞，比如NK92、THP-1、SF9等細胞數量要稍微高點，300-400萬左右為宜。凍存液一般1ml左右每管，這個基本每個實驗室都差不多。
6. 凍存程序選擇
凍存的時候可以選擇用程序性凍存盒直接放到-80度凍存細胞，但要記得異丙醇要及時更換，一般用4-5次異丙醇含水量就超標了，不再適合凍存細胞使用。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h，-80過夜后液氮保存。-80度不適合細胞長期保存，只能短期保存，最好不要超過一周，否則有部分細胞系活性可能會下降很厲害，長期保存的細胞最好放液氮罐保存。
7. 注意凍存檢查
凍存細胞后應在同一批次內隨機選一只細胞復蘇檢測凍存效果， 如果復蘇效果不佳的話需要找到問題所在摸索合適條件重新凍存細胞，如果復蘇良好的就可以放到液氮里長期保存了。這個也是前面推薦將凍存剩下的細胞繼續培養的原因，可以有效避免細胞凍存失敗導致絕種。
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