反向PCR基本原理及實(shí)驗(yàn)步驟
1概述
通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩側(cè)的區(qū)域，轉(zhuǎn)位因子的插入位點(diǎn)以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。為了得到邊側(cè)序列的探針，通常采用擴(kuò)展的PCR方法，使相鄰邊側(cè)區(qū)域得以擴(kuò)增。
2 PCR與反向PCR的區(qū)別
PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段。如圖1所示：
圖1 PCR引物擴(kuò)增方向
圖2 反向PCR引物擴(kuò)增方向
圖3 線性DNA的環(huán)化
通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。如圖4所示：
圖4 反向PCR擴(kuò)增
通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩側(cè)的區(qū)域，轉(zhuǎn)位因子的插入位點(diǎn)以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步移(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。為了得到邊側(cè)序列的探針，通常采用擴(kuò)展的PCR方法，使相鄰邊側(cè)區(qū)域得以擴(kuò)增。
2 PCR與反向PCR的區(qū)別
PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段。如圖1所示：
圖1 PCR引物擴(kuò)增方向
反向PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段。如圖2所示：
圖2 反向PCR引物擴(kuò)增方向
3 反向PCR基本原理
反向PCR（Reverse PCR）是常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的修改和發(fā)展，是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分析研究。
擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子。如圖3所示：
反向PCR（Reverse PCR）是常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的修改和發(fā)展，是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分析研究。
擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子。如圖3所示：
圖3 線性DNA的環(huán)化
通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。如圖4所示：
圖4 反向PCR擴(kuò)增
4 反向PCR實(shí)驗(yàn)步驟
（1）限制性內(nèi)切酶消化
① 選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。
② 根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點(diǎn)（如EcoR I、BamH I、Hind III和Pst I），并在酶切位點(diǎn)上游附近設(shè)計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：
（1）限制性內(nèi)切酶消化
① 選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。
② 根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點(diǎn)（如EcoR I、BamH I、Hind III和Pst I），并在酶切位點(diǎn)上游附近設(shè)計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：
37℃ 過夜，電泳檢測酶切效果。
（2）回收DNA
① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250 μL；
② 加入等體積的酚和氯-仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1 min；
③ 12,000 rpm離心1 min；
④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯-仿，渦旋混勻，室溫靜置1 min；
⑤ 12,000 rpm離心2 min；
⑥ 將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，0.1倍體積的3 M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5 min；
⑦ 4℃ 12,000 rpm離心10~15 min；
⑧ 棄上清，盡量除去管壁上的液體；
⑨ 加入1 mL -20℃預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。12,000 rpm離心5 min；
⑩ 除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉，20~40 μL ddH2O溶解。-20℃保存。
(3) 連接
① 連接體系如下：
（2）回收DNA
① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250 μL；
② 加入等體積的酚和氯-仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1 min；
③ 12,000 rpm離心1 min；
④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯-仿，渦旋混勻，室溫靜置1 min；
⑤ 12,000 rpm離心2 min；
⑥ 將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，0.1倍體積的3 M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5 min；
⑦ 4℃ 12,000 rpm離心10~15 min；
⑧ 棄上清，盡量除去管壁上的液體；
⑨ 加入1 mL -20℃預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。12,000 rpm離心5 min；
⑩ 除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉，20~40 μL ddH2O溶解。-20℃保存。
(3) 連接
① 連接體系如下：
12-14℃，過夜連接。
注：連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進(jìn)分子內(nèi)的連接，減少分子間的連接。
② 連接完成后，65℃水浴10 min滅活。按上述（2）抽提回收，溶解于40 μL ddH2O中。然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。
5反向PCR技術(shù)的不足
注：連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進(jìn)分子內(nèi)的連接，減少分子間的連接。
② 連接完成后，65℃水浴10 min滅活。按上述（2）抽提回收，溶解于40 μL ddH2O中。然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。
5反向PCR技術(shù)的不足
- 需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。
- 大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
- 反向PCR技術(shù)適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究，可用于克隆啟動子。
- 反向PCR技術(shù)有著自己獨(dú)特的特點(diǎn)，雖然有不足之處，但它在各學(xué)科和各領(lǐng)域都有著重要的作用。隨著PCR技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，它在各學(xué)科和各領(lǐng)域的作用將會越來越重要，應(yīng)用也將會更加普遍。
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