DNA提取試劑盒的工作原理及步驟
子生物學實驗中 qPCR、分子克隆、下一代測序等都需要進行DNA提取。
如今，大多數實驗室都使用商業 DNA 提取試劑盒，這些試劑盒使用硅膠自旋過濾法來獲得高質量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA（或 RNA），在這里需要先了解一下DNA 提取試劑盒的工作原理。
核酸提取試劑盒的工作原理
離心柱包含一種硅膠樹脂，可根據鹽條件和受提取方法影響的其他因素選擇性地結合 DNA 和 RNA。這些 DNA 提取試劑盒使整個過程比舊的 DNA 分離方法更容易、更快。但是，使用套件的缺點是，如果您不了解套件的黑匣子中的內容，則會使故障排除變得更加困難。
RNA和DNA提取
裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根據樣品類型，也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實際上在這些變性緩沖液中效果較好；當蛋白質變性增多，蛋白酶 K 的作用也會相應增強。然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進行。
關于質粒制備的注意事項
分離質粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的，因為必須質粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻，您加入離液劑將立即釋放所有物質，并且無法將小環狀 DNA 與高分子量染色體區別開來。因此，在質粒制備過程中中，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結合。
DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結合
離液鹽對于裂解至關重要，而且對于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結合也是如此。此外，為了增強和影響核酸與二氧化硅的結合，還添加了酒精。
大多數情況下這是乙醇，但有時可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多，你會帶入大量降解的核酸和小物種，這會影響 A260 讀數并降低你的一些產量。太少，可能難以從膜上洗掉所有鹽分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請嘗試使用NaCl 作為沉淀劑，以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。
洗滌 DNA（或 RNA）
當裂解物通過硅膠膜進行離心分離，現在所提取的 DNA 或 RNA 應該與柱子結合，雜質、細胞蛋白和多糖應該已經通過了。
但是，膜仍然被殘留的細胞蛋白質和鹽弄臟。如果樣品來自植物，仍然會有多糖，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液，膜可能會被染成棕色或黃色。
通過洗滌的方法去除雜質
通常有兩次洗滌，盡管這可能因樣品類型而異。初次洗滌通常會含有少量的離液鹽，以去除蛋白質和有色污染物。 這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。
如果開始的準備工作沒有大量蛋白質，例如質粒準備或 PCR 清理，則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對于獲得高產量和高純度的 DNA 或 RNA 至關重要。一些試劑盒甚至會用乙醇清洗柱子兩次。
如果殘留鹽分，核酸的洗脫會很差，A230讀數會很高，導致260/230的比率很低。對于無乙醇 DNA 和 RNA，需要進行干法離心，乙醇洗滌后，大多數方案都有一個離心步驟來干燥柱子。這是為了去除乙醇，對于清潔的洗脫液是必不可少的。
當將 10 mM Tris 緩沖液或水應用于膜進行洗脫時，核酸會水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇，則核酸無法完全再水合。如果跳過干燥步驟會導致乙醇污染和低產量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度，所以它不會出現在您的讀數中。
RNA 和 DNA 提取：洗脫法
DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。
對于 DNA 制備，通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩定，在緩沖液中溶解得更快。即使對于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時間內可能無法再與水結合。
通過在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘，可以較大限度地洗脫 DNA。
由于RNA 易溶于水，且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環境下。
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