1.檢測標本

免疫組織化學技術可用于檢測石蠟切片、冰凍切片及細胞涂片。大部分抗體可用于石蠟切片，而適用于石蠟切片的抗體也適用于冰凍切片和細胞涂片。冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織抗原，但是缺點也很明顯，組織形態結構較差，定位不是很清晰。石蠟切片的優點是組織形態結構好，定位清晰，但是在樣品的處理過程中容易破壞組織抗原[4]。下面主要是圍繞實驗室常用的石蠟切片的操作進行總結。

2.組織固定

組織離體后應立即進行固定，盡可能保存組織細胞內的抗原成分和原有的形態結構，防止組織抗原彌散。固定的方式多采用固定液浸泡組織，常用的固定液是甲醛，固定液的濃度是4%甲醛溶液（10%福爾馬林溶液，PH7.2-7.4），固定液用量大概是組織的10-20倍，標記的組織塊不宜過大。判斷組織是否固定良好，可以取出已經固定完畢的組織標本用刀切開，如固定良好，其切面呈灰白色，質感較硬而具有彈性。

3.組織脫水

從固定液中取出的組織，建議用流水沖洗，去除過多的固定液和組織所產生的分解產物，避免污染組織。組織脫水的目的是使得組織內的水分逐步被替換出來，因為組織制成蠟塊是要求組織要被熔化的石蠟所浸透，因為石蠟和水不相溶，脫水干凈后才有助于下一步組織的浸蠟。脫水一般采用從低到高濃度乙醇脫水，組織經過70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，其中95%乙醇和100%乙醇經兩缸試劑脫水。

4.組織透明

組織透明的目的是把脫水劑乙醇將組織內用透明劑（二甲苯）置換出來，以利于熔化的石蠟進入組織，組織經脫水透明后，肉眼可見整塊組織呈透明狀，沒有白色渾濁的狀態，常用的透明劑是二甲苯，在室溫透明時間，組織透明時間以30-60分鐘為宜，不宜過長，依據組織的大小肉眼觀察組織適當調整透明時間。

5.組織浸蠟和包埋

常用的包埋劑是石蠟，石蠟在60-62℃電熱恒溫箱內保持熔化狀態，將組織在其內浸透一定時間，一般組織一般為2-4小時，分2缸石蠟按順序進行操作。包埋時將包埋模具放在自動包埋機的出蠟嘴下方，注入熔化的石蠟，用鑷子把組織輕輕按平，放在自動包埋機的冷凍臺上凝固，凝固后脫去包埋模具。

6.石蠟切片

切片厚度一般為4-5μm，展片可先放在5%-10%的乙醇內然后轉移到恒溫（40-46℃）水中。貼片后切片放滿一抽，放入60-65℃烤箱中烤片20-30分鐘，使得水分蒸發和石蠟熔化，取出即可進行染色。也可45℃烤片數小時，直至將蠟片水分烤干，烤片后的白片可在4℃進行保存。

7. 抗原修復

常用的抗原修復方法主要有蛋白酶法和熱處理法。主要介紹熱處理法，熱處理主要包括加熱、微波爐加熱和高壓鍋加熱，熱處理的溶液常用的是檸檬酸緩沖液（PH=6.0）。加熱條件為：水浴鍋100℃15分鐘，微波爐加熱使溫度保持在95-100攝氏度，總時間10分鐘，中間有間隔。

8.內源性酶的消除

組織中的一些細胞如紅細胞、粒細胞等存在內源性過氧化物酶，這些酶與辣根過氧化酶類似也可以與顯色劑DAB結合，進而造成假陽性，實驗中可通過用3%的過氧化氫水溶液作用15分鐘，消除內源性過氧化物酶操作可以在加一抗之前操作也可在加一抗之后操作。

9.血清封閉

血清封閉的目的是去除非特異性的吸附，用正常的非免疫動物血清封閉組織中的能和抗體結合的位點，減少非特異性的背景，如二抗使用的是山羊抗兔的血清，則封閉血清選擇正常的山羊血清。血清封閉后，不用PBS沖洗，直接棄去即可，直接滴加一抗。

10.抗體孵育

根據實驗需要選擇目標一抗，可根據抗體說明書選擇抗原修復的條件，初次實驗時建議，稀釋不同抗體的濃度，優化最佳的抗體濃度。

11.顯色與復染

常用的染色劑主要是3,3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）,可以直接購買商品化的試劑，DAB的顯色原理是在HRP的催化下，H2O2將DAB氧化成還原型的DAB,還原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀。常見的細胞核復染試劑有蘇木素、甲基綠和核固紅，依據對比清晰的原則，DAB的細胞核復染主要用蘇木素。蘇木素復染后脫水、透明用中性樹膠封片。