關(guān)于細(xì)胞標(biāo)記和熒光素酶的特性，你了解多少？快搭上學(xué)霸問(wèn)答順風(fēng)車，跟我們一起儲(chǔ)備知識(shí)量吧！

01
什么是熒光素酶

熒火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly Luciferase)和海腎熒光素酶(Rellina Luciferase)組成雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay）。通過(guò)加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)過(guò)程中會(huì)發(fā)出生物熒光，然后可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中釋放的生物熒光，從而比較不同組間基因表達(dá)的差異。中喬新舟用的是螢火蟲(chóng)熒光素酶，renilla是海腎。

 

02
下面給大家普及一下可能會(huì)遇到的問(wèn)題：

1.在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？

1.在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？體外培養(yǎng)過(guò)程中，不篩選也可以，只要時(shí)間不是很長(zhǎng)， 接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過(guò)多，建議用藥物篩選一段時(shí)間或從原始的細(xì)胞株培養(yǎng)以保證細(xì)胞發(fā)光的強(qiáng)度，中喬新舟的LUC 、GFP 、RFP及雙標(biāo)記都使用puro抗性篩選。

‍2.底物熒光素(Luciferin）是如何進(jìn)入小鼠體內(nèi)的？需要多少？

熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的，約一分鐘就可以擴(kuò)散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，擴(kuò)散較慢，開(kāi)始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，開(kāi)始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短。大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg 。20克的小鼠約需3mg的熒光素。

3.熒光素酶的發(fā)光特性如何？

通過(guò)腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開(kāi)始發(fā)光，通常十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)。在最高點(diǎn)通常持續(xù)約20-30分鐘后開(kāi)始衰減，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失。通常最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15 - 35分鐘之間，但建議實(shí)驗(yàn)人員在做不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ颓斑M(jìn)行連續(xù)時(shí)間點(diǎn)發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時(shí)間范圍。

 

4. 如何保證熒光素酶（Luciferase）的穩(wěn)定性？

熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體上的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。

 

5. 標(biāo)記的腫瘤接種以后，會(huì)發(fā)生 Luciferase 的丟失嗎？

丟失的可能性及量非常小，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道的結(jié)果中，標(biāo)記的細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)存活幾年的時(shí)間還可以持續(xù)發(fā)光，說(shuō)明 Luciferase 基因的標(biāo)記非常穩(wěn)定。

 

6. 可以用腫瘤塊而不是細(xì)胞接種嗎？

可以先用標(biāo)記的細(xì)胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進(jìn)行原位接種。

 

7. 標(biāo)記細(xì)胞與標(biāo)記基因所用的啟動(dòng)子有何不同？

標(biāo)記細(xì)胞一般用在細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子, 顯示細(xì)胞的數(shù)目。標(biāo)記基因一般用此基因的啟動(dòng)子，與此基因平行表達(dá), 顯示此基因的表達(dá)數(shù)目，中喬新舟使用的啟動(dòng)子是CMV。

 

8. 熒光素酶的表達(dá)高低與所用啟動(dòng)子的活性有關(guān)嗎？

有關(guān)，啟動(dòng)子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動(dòng)子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。

 

9. 常用的熒光素酶？特性如何？

熒光素酶，Luciferase 和 Renilla 熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在 540-600nm，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在 460-540nm 左右。前者所發(fā)的光更容易透過(guò)組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報(bào)告基因， 也有一些文章使用兩者進(jìn)行雙標(biāo)記。

 

10.  組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？

可以，但熒光酶的體外活性保持時(shí)間比較短， 約幾十分鐘。有相關(guān)的文獻(xiàn)。

 

 

03
都有哪些細(xì)胞株提供
1
中喬新舟luc標(biāo)記細(xì)胞部分現(xiàn)貨清單如下：

 

圖1. PC-9和PC-9-gfp-luc細(xì)胞傳代后Luciferase熒光值檢測(cè)結(jié)果

注：

1.建議后期用含puro（2~4ug/ml）的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)；

2.強(qiáng)烈建議收到細(xì)胞后先進(jìn)行細(xì)胞體外分析，及時(shí)向我們反饋；

3.由于本實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，請(qǐng)務(wù)必在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前再次進(jìn)行細(xì)胞體外分析，以免耽誤實(shí)驗(yàn)；

4.檢測(cè)試劑盒使用Promega Bright-Glo Luciferase Assay System。

 

可以提供luc標(biāo)記的定制服務(wù) 周期是3-4周 ‍