免疫共沉淀反應
瀏覽次數:270 發布日期:2019-10-31
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免疫共沉淀反應
1. 轉染后24-48 h 可收獲細胞,加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30 min,細胞裂解液于4°C,最大轉速離心30 min后取上清;
2. 取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜;
3. 取10 μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3 000 rpm離心3 min;
4.. 將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h,使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連;
5. 免疫沉淀反應后,在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3-4次;最后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘;
6. SDS-PAGE,Western blotting或質譜儀分析。