豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟
一、實驗步驟
1. 殺豬后迅速取出甲狀腺 1～2 個，置于盛有 75%酒精的燒杯中，用冰盒送至實驗室(1 h 以內(nèi))。
 
2. 立即置于pH為7.4 的PBS緩沖液(含青鏈霉素)中，反復(fù)漂洗，直至漂洗液清澈透明。
 
3. 去除包膜及結(jié)締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成1mm3 大小的碎塊。
 
4. 置含0.25%胰酶和300 U/ml 膠原酶的容器中，放于 37℃溫箱中消化60 min，每隔15min 需搖動一次。
 
5. 用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。
 
6. 以1000  rpm 離心10分鐘后，棄上清。
 
7. 將細(xì)胞沉淀用F-12 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網(wǎng)(200目)過濾，再以1000 rpm 離心10分鐘，棄上清。
 
8. 沉淀懸于含15% 胎牛血清和1 U/L牛 TSH的F-12 培養(yǎng)基中，臺盼藍(lán)染色證明活細(xì)胞數(shù)大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)板中(1 ml/孔)。
 
9. 置于 37℃的5% CO2 孵箱中，每 2-3 天換液一次，至細(xì)胞融合成片后用于實驗。
 
二、結(jié)果
豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng) 24 小時，鏡下細(xì)胞貼壁，呈聚集生長，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。
 
注意事項
1. 原代培養(yǎng)時，接種的細(xì)胞活性的好壞直接關(guān)系到培養(yǎng)的成敗。
 
2. 組織熱缺血時間短的組織的細(xì)胞活性好。取材后盡量不要耽擱時間，宜盡快處理并培養(yǎng)。
 
3. 對于僅為單純獨立的甲狀腺腺瘤而質(zhì)地較軟的組織，因相對容易消化，消化時間可以適當(dāng)縮短。
 
4. 鏡下觀察接種到培養(yǎng)瓶中的原代細(xì)胞，若大部分為5～10個相連的細(xì)胞小團，就容易生長。