YIJI細胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

 

主要用途

 

YIJI細胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑是一種旨在使用德克薩斯紅標記的DNA酶I，探尋細胞骨架的肌動蛋白單體的分布和局部定向變化狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動物、人體、植物等）的細胞骨架裝配的檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

肌動蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構(gòu)成細胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細肌絲（thin filament），以及細胞膜表面?zhèn)巫悖╬seudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動蛋白存在于所有真核生物細胞中，且高度進化保留，參與各種重要細胞功能，包括細胞遷移、細胞分裂、肌肉收縮、細胞形態(tài)維護、膜轉(zhuǎn)運（membrane trafficking） 等。哺乳動物具有六種異構(gòu)體，分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白（G-actin）在生理條件下，組合成長絲聚合體，轉(zhuǎn)化為絲狀肌動蛋白（F-actin），形成細胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態(tài)學(xué)變化是細胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數(shù)之一。牛胰腺DNA酶I（DNase I）具有與肌動蛋白單體（G-actin）高度親和力結(jié)合的特征，因此通過德克薩斯紅（Texas Red）標記的DNA酶I可以體外探測細胞G-肌動蛋白的分布和含量，據(jù)此分析細胞骨架裝配的調(diào)控機制。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）        毫升

YIJI固著液（Reagent B）        毫升

YIJI通透液（Reagent C）        毫升

YIJI封阻液（Reagent D）        毫升

YIJI染色液（Reagent E）      微升

YIJI復(fù)染液（Reagent F）       微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI染色液（Reagent E）和YIJI復(fù)染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細胞熒光觀察

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升YIJI通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升YIJI染色液（Reagent E）和YIJI復(fù)染液（Reagent F），混勻后，標記為YIJI染色工作液，置于冰槽里，放進暗室里備用。然后進行下列操作。

 

• 直接法

 

1. 準備1個細胞培養(yǎng)6孔板，內(nèi)置1個細胞1 X 1 cm大小的載玻片
2. 接種待測細胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達70％
3. 小心抽去細胞培養(yǎng)液
4. 輕輕加上xx微升YIJI清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
5. 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
6. 輕輕加上xx微升YIJI固著液（Reagent B）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
7. 置于冰槽里孵育30分鐘
8. 小心抽去YIJI固著液（Reagent B）
9. 輕輕加上xx微升YIJI通透液（Reagent C）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
10. 小心抽去YIJI通透液（Reagent C）
11. 輕輕加上xx微升YIJI封阻液（Reagent D）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
12. 室溫下孵育30分鐘
13. 小心抽去YIJI封阻液（Reagent D）
14. 輕輕加上xx微升YIJI清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
15. 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
16. 重復(fù)實驗步驟14和15一次
17. 小心加上xx微升YIJI染色工作液， 覆蓋樣品表面
18. 在暗室里室溫下孵育60分鐘
19. 小心抽去YIJI染色工作液
20. 輕輕加上xx微升YIJI清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面
21. 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
22. 封片
23. 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數(shù)200個細胞）：激發(fā)波長597nm，散發(fā)波長618nm（G-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

• 間接法

 

1. 準備1個25cm²細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞，直至鋪滿率達70％（約100萬細胞數(shù)）
2. 小心移出細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）
3. 加入2毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面
4. 小心移出2毫升YIJI清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管
5. 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細胞表面
6. 放進37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
7. 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
8. 加入3毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
9. 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞可以由此步開始）
10. 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
11. 小心抽去上清液
12. 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
13. 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管
14. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15. 小心抽去上清液
16. 加入500微升YIJI固著液（Reagent B），混勻
17. 置于冰槽里孵育30分鐘
18. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19. 小心抽去上清液
20. 加入500微升YIJI通透液（Reagent C），混勻
21. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
22. 小心抽去上清液
23. 加入500微升YIJI封阻液（Reagent D），混勻
24. 室溫下孵育30分鐘
25. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
26. 小心抽去上清液
27. 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
28. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
29. 小心抽去上清液
30. 加入100微升YIJI染色工作液
31. 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群
32. 在暗室里室溫下孵育60分鐘
33. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
34. 小心抽去上清液
35. 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
36. 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）
37. 小心抽去上清液
38. 加入200微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
39. 即刻移取10微升在載玻片上壓片
40. 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數(shù)200個細胞）：激發(fā)波長597nm，散發(fā)波長618nm（G-肌動蛋白染色）或激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環(huán)或橢圓狀

 

注意事項

 

1. 本產(chǎn)品為10次操作
2. 在整個操作過程中須戴手套，以防污染
3. 孵育時，必須避免光照
4. 建議檢測細胞量達10⁶細胞數(shù)為佳
5. 用戶可以根據(jù)情況，適度調(diào)整試劑用量
6. 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光分析，不宜超過1小時
7. 本公司提供系列細胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰