報告基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因,其表達產物非常容易被鑒定。把它的編碼序列和基因調節序列相融合,在調控序列控制下進行表達,從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。
作為報告基因必須具備的條件:
(1)全序列已測定
(2)表達產物在手提細胞中不存在,即無背景,在被轉染的細胞中無相似的內源性表達產物
(3)其表達產物能夠進行定量測定
報告基因的種類很多,根據對其表達產物的分析檢測方法的不同,可將其分為體外報告基因和體內報告基因。前者的分析需要在含有報告分子的細胞裂解液或細胞、組織培養液(分泌型報告基因)中進行報告分子的定量。較典型的有氯霉素乙酰基轉移酶基因(CAT)、人生長激素基因(hGH)及分泌型堿性磷酸酶基因(SEAP)等。后者的分析可以在活的細胞或組織中,或在已經組化固定的組織或細胞中進行。較典型的如綠色熒光蛋白基因(GFP)。而β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)和螢火蟲熒光素酶基因既可以在體外分析也可以在體內分析。
常用的報告基因系統:
√ 半乳糖苷酶報告系統
√ 熒光素酶報告系統
√ 熒光蛋白報告系統:
綠色熒光蛋白(GFP):
可溶性蛋白,性質穩定;
熒光基團相當明亮;
熒光在活細胞中即可觀察,不需要固定和組織加工;
GFP基團和目的基因做成融合蛋白后,可以通過轉染的方法在細胞中穩定表達;
表達GFP融合物的細胞能夠在生活狀態進行實驗和檢測。
報告基因 |
優點 |
缺點 |
氯霉素乙酰轉移酶基因 (CAT) |
在哺乳動物中沒有內源性活性;可用自動化的ELISA方法檢測 |
線性范圍窄;靈敏度相對較低;需要使用放射性同位素 |
β-半乳糖苷酶基因(β-Gal) |
蛋白穩定;生物或化學發光檢測靈敏;不需要使用同位素 |
在哺乳動物細胞中有內源性活性 |
人生長激素基因(hGH) |
屬于分泌型報告蛋白;操作簡便 |
靈敏度相對較低;線性范圍較窄 |
分泌型堿性磷酸酶基因(SEAP) |
化學發光檢測法非常靈敏;線性范圍較寬;價格便宜 |
在某些細胞中具有內源性表達;與篩選的化合物相互干擾 |
熒光素酶基因(Luciferase) |
靈敏性好;線性范圍寬;沒有內源性表達;測定方法簡便 |
蛋白的半衰期較短;常規分析重復性差 |
綠色熒光蛋白基因(GFP) |
自發熒光(不需要底物);沒有內源性表達;有多種突變體可應用 |
需要翻譯后加工;敏感性較低(沒有信號的放大) |