實(shí)驗(yàn)材料煙草細(xì)胞：BY-2

實(shí)驗(yàn)步驟

1. BY-2 細(xì)胞培養(yǎng)

BY -2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在搖床上，避光，溫度260 C，轉(zhuǎn)速130r pm，每7天將 1m l 細(xì)胞轉(zhuǎn)入20m l新鮮的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。BY -2 愈傷組織生長在固體培養(yǎng)基上，每3-4周繼代一次。轉(zhuǎn)基因的懸浮細(xì)胞和愈傷組織生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中。

2. 用干轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101的準(zhǔn)備

(1)接種農(nóng)桿菌單菌落到2 ml新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，28“培養(yǎng)過夜;

(2)取200ul培養(yǎng)物加到l0ml新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時:

(3) '5000 rpm,離心5 min集菌，用BY-2液體培養(yǎng)基重懸菌體，OD為0.5左右，待用。

3. 農(nóng)桿藺介導(dǎo)的BY-2懸浮細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)化

(1)取生長到第3或4天的BY-2細(xì)胞4 ml，加入上述備用的農(nóng)桿菌液100ul，共培養(yǎng) 3天;

(2) 500 g離心2 min，收獲細(xì)胞并用BY-2液體培養(yǎng)基(Amp 500 mg/L)洗3次 :

(3)將細(xì)胞稀釋后鋪于BY-2固體培養(yǎng)基的平板(Kan 100 mg/L, Amp 500mg /L )上，26℃黑暗培養(yǎng)。

(4)四周后，取出生長良好的愈傷小塊，打散后放入液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。

4. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BY-2愈傷組織的外源基因轉(zhuǎn)化

(1)取培養(yǎng)2-3周的煙草愈傷組織小塊浸入農(nóng)桿菌液中20 min，取出用無菌濾紙吸干，置BY-2 培養(yǎng)基平板(無抗生素)上培養(yǎng)2天;

(2)取出愈傷小塊，用無菌水洗4次，然后用含抗生素(Amp 500 mg/L)的無菌水浸泡30-60m in;

(3)取出愈傷小塊，用無菌濾紙吸干，置于培養(yǎng)BY-2的平板(Amp500mg/L，Kan100mg/)上。

(4)培養(yǎng)四周后，挑出生長的愈傷小塊，轉(zhuǎn)移到新的抗性平板(Kan 100 mg/L)

上繼續(xù)生長;

(5)取出生長良好的愈傷小塊，打散后放入液體培養(yǎng)基中，26'C, 130 rpm,在搖床上黑暗培養(yǎng);

(6)每7天繼代一次。