PCR擴增產物鑒定與純化1
實驗原理
實驗試劑
實驗設備
實驗材料
實驗步驟
1. 使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。（參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗）
2. 在紫外燈下切出含有目的DNA（約600bp）的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時應注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。
注意：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。
3. 切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。
4. 稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1mg=1µL進行計算。
5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：
| 凝膠濃度 | DR-I Buffer 使用量 |
| 1% | 3個凝膠體積量 |
| 1%-1.5% | 4個凝膠體積量 |
| 1.5%-2% | 5個凝膠體積量 |
6. 均勻混合后75℃加熱，融化膠塊（低熔點瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱）。此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6～10分鐘）。
注意：膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響DNA的回收率。
7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當分離小于400 bp的DNA片段時，應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。
8. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 將上述操作7的溶液轉移至Spin Column中，12000 rpm離心1min，棄濾液。
注意：如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。
10. 將500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。
11. 將700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。
12. 重復操作步驟11。
13. 將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 µL的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。
注意：使用加熱至60℃的滅菌蒸餾水或Elution Buffer有利于提高洗脫效率。
14. 12000 rpm離心1min洗脫DNA。
-20℃低溫保存純化的目的DNA片段。
