免疫電鏡技術關鍵的幾個問題

免疫電鏡集電子顯微技術與免疫細胞化學技術于一體，能顯示抗原或抗體在細胞超微結構水平的位置，已成為當今生物醫學領域的一項重要研究手段。由于免疫電鏡制作過程長，操作程序煩鎖，因此，要得到滿意的免疫金染色切片，必須在關鍵環節上給予注意，以下我們就免疫電鏡染色技術中的幾個問題進行探討。（相關實驗技術服務：免疫電鏡技術服務）

1、染色標本的固定
理想的免疫電鏡標本固定既要保存組織的抗原，又要具有良好的細胞超微結構。對于多數抗原，按常規電鏡技術固定標本會使其抗原性部分或完全消失，因此，免疫電鏡常用一些特殊的固定液，如過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液( PG)（相關試劑：戊二醛 25%溶液）及苦味酸-多聚甲醛固定液。我們在實際工作中發現，用1%多聚甲醛加0.01% -0.05%的戊二醛最理想。此固定液不但配置簡單，而且效果滿意。當然，對于某些抗原性較強的標本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定。有的甚至可以直接采用常規電鏡固定液固定。

2、包埋劑的選擇
被檢組織采用包埋前或包埋后方法進行免疫染色，應視被標記抗原的情況而定。通常對僅檢測細胞表面的抗原選擇包埋前染色，這樣，不存在脫水、浸透及聚合對細胞抗原的破壞規包埋劑即可。相反，包埋后染色是在標本包埋后才進行免疫染色，對抗原常常造成較大的破壞，因此，應根據待檢抗原的性質選擇合適的包埋劑．以減少對抗原的破壞，提高陽性檢出率。Epon812為最常用的電鏡包埋劑，它要求標本在包埋前必須徹底脫水，一般還需要在60℃聚合，因此，對抗原性往往有較大的破壞。我們在工作中采用低溫長時間聚合，45℃3天，日的減少聚合反應對抗原性保存的影響。為了減少對組織抗原性的破壞，以獲得很強的陽性染色結果，不少實驗室應用低溫包埋劑、透明合成樹脂及水溶性包埋劑（乙二醇甲酯）。通常在鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術的包埋后染色中，采用低溫包埋劑。

3、抗血清和探針
要獲得理想的免疫染色，選擇具有特異性高、親和力強的抗血清是實驗成功的首要條件。一般實驗所用的一抗都是通過市場購買（點擊查看：查找抗體），購置的一抗濃縮液在使用前須用抗體稀釋液稀釋，本文認為包埋后免疫電鏡染色用的一抗濃度要高于光鏡染色的使用濃度10~100倍。有時造成染色失敗的原因之一，就是因為把光鏡免疫組化染色的抗體作為一抗。
探針一般用于電鏡下觀察，通常使用膠體金顯示。膠體金探針既可以通過市場購買，也可以按Slot方法自己制備。一般制備的膠體金直徑為5nm，10nm，15nm幾種規格。

4、特異性吸附問題
免疫電鏡染色時，通常使用膠體金作為探針，然而膠體金是一種高度敏感的探針，如何克服背景，提高染色結果的特異性便成為膠體金免疫電鏡檢查的關鍵環節。使用效價高、特異性強的一抗和活性穩定、濃度適當的免疫金探針以及高質量稀釋度合適的抗體是克服背景污染、獲得理想標記結果的重要條件。隨著稀釋度的增加，污染蛋白的影響會逐漸減弱。一般在檢測某種新的抗原時，須通過方陣滴定來確定一抗及金標抗體的稀釋度。另外，還可以使用高鹽及含去污劑的緩沖液進行洗脫，以減少背景污染，通常在緩沖液中加入氯化鈉及Triton X-100，使其濃度分別為2.5%及1%即可。當然一抗和金探針時問的合適，也很重要。一般時間一抗24 h(4℃)，金探針常溫2h。在實驗中，我們常用正常羊血清(1:50-1:100)或1%牛血清白蛋白作為封閉劑，以阻斷非特異性吸附。