選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很重要。PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS，TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱。一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選TBS；陽離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液首選PBS。Western blot中使用PBS和TBS均可，根據(jù)需要選擇合適的濃度。

 不一定，因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的，有的是識(shí)別構(gòu)象型表位，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于Western blot，因?yàn)樵赪estern blot中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。

最好不要同時(shí)加兩種一抗，因?yàn)槿绻�結(jié)果里面有非特異性信號(hào)的話，就說不清楚。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL顯色、壓片、洗片，漂洗后加內(nèi)對照的一抗、二抗、ECL顯色、壓片，洗片。

可以考慮，轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇，因?yàn)榧状伎梢越档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入終濃度0.1% SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜，低濃度膠，提高轉(zhuǎn)移電壓/電流，增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

 一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致，這樣才有說服力。表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或人為造成目的條帶濃度的變化，嚴(yán)格意義上講，內(nèi)參是必須的。