PCR常見問題及解決方案
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問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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無產物或產量低 |
模板濃度偏低或偏高 |
電泳檢測模板濃度，調整模板用量 |
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模板降解 |
重新制備；基因組DNA、cDNA應小量分裝后低溫保存 | |
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模板中含有抑制反應的雜質 |
純化模板 | |
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引物濃度不足 |
調整引物濃度，特別是針對長片段PCR | |
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引物存在二級結構 |
重新設計引物，避免二級結構；優化退火溫度 | |
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引物降解 |
引物應高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復凍融 | |
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Mg2+濃度偏低 |
適當提高Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
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dNTP降解 |
-20℃保存，小量分裝，避免反復凍融 | |
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酶純度低，擴增效率差 |
選用高質量DNA聚合酶 | |
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酶量不足 |
適當增加酶量 | |
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用酶不當 |
針對模板、目標片段的特選擇適當的酶(詳見PCR產品選擇指南) | |
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緩沖液失效 |
更換緩沖液或使用預混PCR反應體系 | |
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模板變性不充分 |
適當延長變性時間；對高GC或復雜結構模板，提高起始變性溫度至98℃ | |
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退火溫度偏高 |
降低退火溫度，應比引物Tm低至少5℃ | |
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延伸時間不足 |
增加延伸時間，特別是針對長片段PCR | |
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循環數目不夠 |
增加循環數 | |
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PCR管污染 |
質量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應先高溫高壓滅菌處理；用過的PCR管不可清洗后重復使用 | |
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PCR儀故障 |
檢查程序和模塊溫度 | |
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其他 |
使用PCR增強劑 | |
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非特異產物過多 |
體系污染 |
設計對照實驗尋找污染源，操作時應注意避免交叉污染 |
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引物濃度過高 |
適當減少引物濃度 | |
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引物序列特異性差 |
重新設計引物 | |
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Mg2+濃度過高 |
降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
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dNTP濃度過高 |
降低dNTP濃度 | |
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酶量過多 |
減少酶量，以0.5 U間隔遞減 | |
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退火溫度過低 |
提高退火溫度 | |
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延伸時間過短 |
增加延伸時間，以1 min間隔遞增 | |
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循環次數過多 |
減少循環次數 | |
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模板結構過于復雜或目標片段過長 |
特選擇適當的酶(詳見PCR產品選擇指南)；使用PCR增強劑 | |
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其他 |
HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR | |
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引物二聚體 |
引物3’末端存在互補序列 |
重新設計引物 |
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引物濃度過高 |
降低引物濃度 | |
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模板濃度過低 |
提高模板濃度 | |
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退火溫度不合適 |
優化退火溫度 | |
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循環次數過多 |
減少循環次數 | |
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其他 |
HotStart PCR | |
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拖尾嚴重 |
引物濃度過高 |
調整引物濃度 |
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引物序列特異性差或模板上存在同源序列 |
重新設計引物 | |
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模板降解 |
重新制備模板 | |
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模板濃度過高 |
降低模板濃度 | |
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dNTP濃度過高 |
減少dNTP用量 | |
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Mg2+濃度過高 |
降低Mg2+濃度，從1 mM到3 mM以0.5 mM間隔遞增，針對不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度 | |
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酶量過多或質量差 |
減少酶量，以0.5 U間隔遞減；更換質量可靠的酶 | |
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變性溫度過低 |
提高變性溫度，以0.5℃遞增 | |
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退火溫度過低 |
提高退火溫度 | |
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延伸時間過長 |
縮短延伸時間 | |
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循環次數過多 |
減少循環次數，以2個循環間隔遞減 | |
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體系污染 |
設計對照實驗，消除污染源 | |
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其他 |
HotStart PCR
TouchDown PCR
巢式PCR | |
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假陽性 |
目標片段與非特異擴增片段間存在同源性 |
設計陰性對照，確認為引物問題后重新設計引物 |
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體系污染 |
設計陰性對照判斷是否有污染，去除污染源 |
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