NimbleGen大麥外顯子組捕獲快速定位多節矮稈突變基因
在農業生產中，性狀相關的基因定位對于科學育種十分重要，傳統的遺傳重組定位具有指導意義和實用價值，但傳統方法周期長、耗費大。隨著二代測序的發展，DNA測序速度大大加快、成本大大降低，使得通過測序法進行的基因定位（mapping-by-sequencing）成為越來越多動植物研究的主要手段。對合適的樣本群體，在完整的基因組參考序列的條件下，結合傳統集群分離分析(BSA)和二代測序方法，可以快速定位性狀相關基因。在短短幾天內，可通過數據運算界定出基因所在區域，進一步鎖定基因。這一方法已經在擬南芥、水稻、玉米、小鼠、斑馬魚等等的基因定位中得到了應用。
通常這一應用的前提需要一個高質量、較完整的參考基因組序列，包括所有基因及其他基因組序列信息。然而，在農業中的許多重要作物，如大麥、小麥等等的基因組圖譜并不完整。最近德國科學家在Genome Biology上發表文章1，介紹了通過外顯子組二代測序方法定位一個影響大麥出葉速率(leaf initiation rate)的基因，表明即使在基因組并不完整的情況下也可以進行測序法的基因定位。
此次研究針對大麥多節矮稈突變體(mnd)，這一突變體的最顯著特點是葉間期縮短，出葉速度加快，葉子數量平均為野生型的2倍，節間莖稈長度縮短，并伴有葉子形狀的改變等等。利用X光誘發的多節矮稈突變體與野生型cv. Barke雜交獲得F2代，在100個F2中有19%為突變型、81%為野生型，該性狀為單基因隱性遺傳。取18個突變體的DNA混合成一個突變樣本群的DNA混合物，再隨機選取30個野生型混合成野生型樣本群的DNA混合物，對這兩個DNA混合物分別用NimbleGen大麥外顯子組探針富集大麥基因組的編碼序列后，進行二代測序。
圖：基因定位：通過突變樣本群和野生樣本群等位基因頻率的差異定位候選基因。摘自Mascher M, Jost M, Kuon JE, Himmelbach A, Aßfalg A, Beier S, Scholz U, Graner A, Stein N. Mapping-by-sequencing accelerates forward genetics in barley. Genome Biol. 2014. Jun 10;15(6):R78
突變樣本群和野生型樣本群分別獲得8.2 Gb和7Gb測序數據，比對cv. Barke的全基因組鳥槍法測序拼接結果后，分析SNP位點及其等位基因頻率。比較2個樣本群的SNP位點等位基因頻率，在染色體5H長臂發現一個30cM區域，該區域內突變型的SNP等位基因頻率達95%，而野生型的SNP頻率僅為30%。同時，由于X光所引發的突變多為缺失突變，在測序數據中通過測序深度尋找>150bp的缺失突變，發現有18個缺失位于上述區域。在缺失片段對應的contig中，contig 49382位于5H 96 cM，有2個缺失區域，是一個被注釋為“Cytochrome P450”的MLOC_64838.2基因的2個外顯子。Blastn的結果顯示這個基因編碼的蛋白與水稻PLASTOCHRON1 (pla1)基因編碼的蛋白序列相似，pla1基因的突變會使得水稻有類似大麥多節矮稈突變體的表型，作者認為MLOC_64838.2基因很可能是控制這個形狀的基因。文章還在其他大麥多節矮稈突變體中進行了這個基因的驗證，并在大麥的物理圖譜中定位了這個基因。作者認為，利用大量現有的大麥突變體資源，結合外顯子組測序、合理數據分析方法以及現有的基因組資源，可以經濟有效地對大麥進行測序法的基因定位(mapping by sequencing)，同樣的方法也可以用于其他基因組龐大的物種的類似研究。
此文中所用的NimbleGen大麥外顯子組探針設計基于現有大麥基因組拼接的注釋，并參考全長RNA序列以及RNASeq測序序列設計，總共約88.6Mb目標序列，對應目前大麥基因組中~60Mb左右的編碼區域。大麥外顯子組捕獲產品在一個捕獲反應溶液中有約420萬種不同的DNA探針，體現了NimbleGen高密度探針的生產和設計能力，可以有效覆蓋和捕獲目標區域。2013年11月在The Plant Journal發表的一篇文獻2，也運用該大麥外顯子組捕獲產品，對不同品系的種植大麥及野生大麥進行了實驗，隨后進行SNP發現、多樣性分析和進化分析，文章指出這個工具可以應用于多種品系的大麥、甚至小麥，幫助mRNA編碼區的變異研究，通過混合捕獲和減少測序量大大降低研究成本，從而推進大麥遺傳多樣性及基因性狀研究。
1. Mascher M, Jost M, Kuon JE, Himmelbach A, Aßfalg A, Beier S, Scholz U, Graner A, Stein N.Mapping-by-sequencing accelerates forward genetics in barley. Genome Biol. 2014. Jun 10;15(6):R78.
2. Mascher M, Richmond TA, Gerhardt DJ, Himmelbach A, Clissold L, Sampath D, Ayling S, Steuernagel B, Pfeifer M, D'Ascenzo M, Akhunov ED, Hedley PE, Gonzales AM, Morrell PL, Kilian B, Blattner FR, Scholz U, Mayer KF, Flavell AJ, Muehlbauer GJ, Waugh R, Jeddeloh JA, Stein N.Barley whole exome capture: a tool for genomic research in the genus Hordeum and beyond.Plant J. 2013 Nov;76(3):494-505. doi: 10.1111/tpj.12294. Epub 2013 Aug 24.
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