細胞技術專題：大鼠大腦皮層神經元細胞培養(yǎng)實驗
大鼠大腦皮層神經元細胞培養(yǎng)可以：（1）獲得大鼠大腦皮層神經元細胞；（2）用于神經元細胞定向分化研究；（3）用于神經元細胞凋亡研究。
實驗方法
- 機械性劃割培養(yǎng)
- 酶消化法
| 實驗方法原理 | SD胎鼠腦皮層神經元體外培養(yǎng)7 d，微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內機械性劃割培養(yǎng)之神經元，依劃割程度不同分為輕、中、重3組，對照組除不進行機械性劃割，其余處理同損傷組，傷后不同時間點（10，30min ， 1，3，6，12，24 h）檢測細胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
SD大鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’ |
| 儀器、耗材 |
眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱 |
| 實驗步驟 |
一、實驗步驟
1. 孕16 d SD 大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的 D-Hanks’平衡鹽液中。
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。
3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內終止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。
5. 將所收集的上清經200 目篩網過濾。
6. 過濾后的細胞懸液于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細胞懸液。
7. 細胞計數，調整細胞密度按1.5×105/cm2 種入6 孔板內，放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1×10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。 |
| 注意事項 |
1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。
2. 上面雖然時大鼠皮層神經元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇孕13 d 左右的小鼠。
3. 神經元是一種比較難培養(yǎng)的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠。
4. 在玻片上培養(yǎng)神經元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經細胞的影響 是很大的。如果您現在在玻片上培養(yǎng)的神經元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養(yǎng)中最好還是用同 一來源(廠家)的玻片。
5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基，那么就方便了(不用加 AraC):
(1)把細胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 半量換液。
(2)把細胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種。
(3)可以用新生1 d 內的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。
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