細(xì)胞技術(shù)專題：小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)可以：（1）用于細(xì)胞保種；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 胰酶消化法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
小鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
DMEM 無血清DMEM培養(yǎng)基 胰酶 PBS |
| 儀器、耗材 |
飯盒 紗布 剪子 鑷子 燒杯 平皿 研磨玻片 濾網(wǎng) 離心管 6孔培養(yǎng)板 吸管 移液管 手套 微量加樣器 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 動(dòng)物：小鼠。
2. 試劑：DMEM(含血清)、無血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS。
3. 器械：飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網(wǎng)、離心管(15/50 ml)、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器。
4. 準(zhǔn)備：酒精擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
二、方法
1. 將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡2-3秒鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。
2. 剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有PBS液的平皿中。
2.3 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約1mm2)，玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心(1 000 rpm，5 min)。
4. 視組織或細(xì)胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
5. 加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。
7. 再次離心5 min，棄上清液。
8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml(視細(xì)胞量)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
10. 將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng) |
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