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流式細胞儀的分析及分選原理

瀏覽次數:5434 發布日期:2013-12-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
流式細胞儀由液流系統、光學與信號轉換測試系統和數字信號處理及放大的計算機系統三大基本結構組成。在對細胞懸液中的單個細胞或其超微結構進行多參數快速自動分析過程中,每秒鐘能測量數千個至數萬個細胞,能在分析過程中按實驗設計要求對特定細胞進行分析,帶細胞分選系統的流式細胞儀還可按實驗設計要求分選出具相同特征的同類型細胞,用于培養或進一步研究。
一、工作原理
流式細胞儀的工作原理借鑒了熒光顯微鏡技術,將熒光顯微鏡的激發光源改為激光,使其具有了更好的單色性與激發效率,同時利用熒光染料與單克隆抗體技術的發展,提高了檢測的靈敏度和特異性,并將固定的標 本臺改為流動的單細胞懸液,用計算機進行光信號的數據處理分析,提高了檢測速度與統計分析的精確性能。能同時從一個細胞上獲取多種參數資料。
(一)基本組成結構
1.液流系統
由樣本和鞘液組成。待測細胞被制備成單個細胞懸液,經熒光染料標記的單克隆抗體染色后置入樣品管中,在清潔氣體壓力下進入流動室形成樣本流;鞘液是輔助樣本流被正常檢測的基質液,其主要的作用是包裹在樣本流的周圍,使其保持處于噴嘴中心位置以保證檢測精確性,同時又防止樣本流中細胞靠近噴孔壁而堵塞噴孔。細胞懸液進入鞘液中的孔徑通常 為 50~300μm孔徑。
2.光學系統
由激光光源、分光鏡、光束成形器、透鏡組和光電倍增管組成。
(1)激光光源:現代流式細胞儀采用的多為氣冷式氬離子激光器;
(2)分色反光鏡:作用是反射較長波長的光,通過較短波長的光。
(3)光束成形器:由兩個十字交叉放置的圓柱形透鏡組成,作用是將激 光器發射的激光束聚焦成高 15μm,寬 57 μm的橢圓光斑。
(4)透鏡組:有三個透鏡,作用是將激光和熒光變成平行光,同時除去離散的室內光。
(5)濾片:長通濾片一允許長于設定波長的光通過;短通濾片一允許短于設定波長的光通過;帶通濾片一允許一定帶寬的波長通過,其他波長的光不能通過,有 525 nmBP,575 nmBP,620 nmBP,675 nmBP 4 個。
(6)光電倍增管(pholomultiplier tube,PMT):由 FS,SS,FLl,FL2, FL3,FIA 組成,主要作用是檢測熒光和散射光,同時將光學信號轉換成電脈沖(數字數據)信號。當調整 PMT 電壓,脈沖信號也發生改變。
3.數據處理系統
主要由計算機及其軟件組成。能對實驗分析數據的存儲、顯示和分析更加智能化和自動化,是流式細胞儀組成部件中的重要環節。
(二)基本工作原理
按檢測需要標記了特異性熒光染料的單細胞懸液和鞘液,分別經硅化管進入流動室,形成鞘液包裹細胞懸液的穩態單細胞液柱,該液柱以穩定的層流形式通過噴嘴高速射下,液柱與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交,單個細胞上標記的熒光染料在通過激光光斑時被激發而產生特異性熒光,同時,由于混合細胞群中細胞大小和胞內顆粒的多少會被激發而產生不同的散射光。在入射光束與液柱垂直的方向有熒光檢測系統和散射光感受系統,用于收集熒光信號和側向散射光信號,前向散射光感受器在前向小角探測接受前向光信號。被接收的光電信號被光電倍增管轉換成電壓脈沖和積分脈沖,使信號放大,該信號進入計算機系統進行數據轉換,儲存,分析,處理,按不同的檢測設計采用相應軟件程序對結果進行綜合分析,并以圖像和數據顯示于熒光屏上,包括了單參數和二維或三維圖像資料,陽性細胞百分率,x±s,斜率,峰值,峰面積等多參數資料。一臺好的流式細胞儀每秒可測量 15 000 個細胞,測定 1 000 個熒光染料分子的粒子,這是目前其他儀器尚無法做到的。
 

標簽: 流式細胞儀
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