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蛋白質技術專題:蛋白質回收實驗

瀏覽次數:747 發布日期:2013-12-17  來源:上海北諾生物科技有限公司

 

回收試驗,是“對照試驗”的一種。當所分析的試樣組分復雜,不完全清楚時,向試樣中加入已知量的被測組分,然后進行測定,檢查被加入的組分能否定量回收,以判斷分析過程是否存在系統誤差的方法。所得結果常用百分數表示,稱為“百分回收率”,簡稱“回收率”。

實驗方法
  • 基本方案
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
1.  凝膠浸泡在染色液中于室溫緩慢搖動染色15~20 min,然后移至脫色液中于4℃溫和搖動下脫色2~3 h。

2.  切下染色后的凝膠條帶,于4℃水中浸泡2~3 h,期間換幾次水。然后分別將每條膠移入Petri培養皿中,加入10 ml 水覆蓋之,并將它們搗碎成約1 mm3的碎片,再用巴斯德吸管將水吸千。
 
3.  用一園片狀的Spectrapor 6透析膜將電洗脫儀的洗脫池的底端蓋好,并擰緊帽子
 

圖一、洗脫池

4.  將搗碎的凝膠移入洗脫室的粗大的一端,并以浸泡緩沖液覆蓋,在浸泡液之上,加入一層冼脫液,使之剛沒過水平隧道,排除氣泡。
 
5.  將洗脫室置于洗脫池之內,加入洗脫液至僅高于各電極槽的排液出口, 將其余的液體加入小混合池中。
 
6.  連接雙通道蠕動泵,調整流速使溶液能緩饅地從混合池中滴回洗脫池。用彎頭巴斯德吸管吸去洗脫室透析膜下的所有氣泡,小心不要戳穿透析膜。
 
7.  將凝膠碎片浸泡3~5 h。連接電極,注意將陰極連接于冼脫室有凝膠碎片的一側。50 V 恒壓12~16 h。
 
8.  關電源,撤去與電極的連接,以透析液代替洗脫罐中的冼脫液。重新連接電極,在80 V 恒壓下12〜24、
 
9.  關電源,撤去與電極的連接,關閉蠕動泵。從罐中取出洗脫室,吸去含洗脫蛋白的收集池中藍色蛋白層上面的緩沖液,以帶平嘴針頭的50 μl 注射器混勻剩余的含蛋白液體。
 
10.  將蛋白溶液移入一微量離心管中,用50 μl 透析液洗收集池,并合并于蛋白液。
 
11.  在Speedvac蒸發器中凍干液體,樣品可在-20℃保存。
 
 

圖二、洗脫儀及洗脫池

12.  樣品用100 μl 水重溶,并以50:50甲醇/丙酮沉淀。-20℃過夜,微量離心沉淀蛋白。
 
13.  取5%~10%樣品用Laemmli凝膠系統的微型膠分折蛋白冼脫的程度、分子量和回收率,蛋白質可用考馬斯亮藍或銀染法檢測。

14.  將剩余的樣品加樣于瀏序濾膜,用于蛋白質序列分析。
發布者:上海北諾生物科技有限公司
聯系電話:021-57730393,15800960770
E-mail:beinuobio@163.com

標簽: 蛋白質 回收
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