PCR技術專題：反向PCR （inverse-PCR）實驗步驟
inverse-PCR是克隆插入片段側翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。
基本步驟如下：
1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側翼DNA序列非常有效的方法。
a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設計引物P1、P2；
b. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA片段環(huán)化；
c. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側翼序列的片段。
2、限制性內(nèi)切酶消化：選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應對基因組DNA定量。
根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：
| Buffer for EcoR I | 2μl |
| Genomic DNA | 3μl |
| EcoR I | 0.5μl （10u/μl） |
| ddH2O | 14.5 μl |
| 20μl |
37度 過夜，電泳檢測酶切效果。
3、回收DNA
① 將酶切產(chǎn)物轉到1.5ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250μl；
② 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1min；
③ 最大速度（13, 000 rpm）離心1min；
④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1min；
⑤ 最大速度（13, 000 rpm）離心2min；
⑥ 將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預冷的無水乙醇，0.1倍體積的3M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5min；
⑦ 4℃最大速度（13, 000 rpm）離心10~15min；
⑧ 棄上清，盡量除去管壁上的液體；
⑨ 加入1ml -20℃預冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。最大速度（13, 000 rpm）離心5min；
⑩ 除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。
4、連接。體系如下：
| DNA | 2μl |
| 10×buffer | 10μl |
| T4 ligase | 1μl |
| ddH2O | 87μl |
| 100μl |
12-14℃ overnight
連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進分子內(nèi)的連接，減少分子間的連接。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14℃連接48h）。連接完成后，65℃ 水浴10min滅活。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中。
然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。
