解析免疫組化染色出現無色片的原因及解決方法
良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結果的基礎和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環節，每一個步驟或環節都可能影響到染色的最終結果，因此，要做好一張高質量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術員和病理醫生密切配合、相互協調、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題，但從染色的結果看，一般可分為兩類：無色片（即無陽性信號）和“ 雜音”染色片（有陽性信號）。以下解析“無色片”。
染色結束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能：
1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題，組織或細胞確實不表達與抗體相關的抗原。
2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。
假陰性結果又可分為兩種情況：
（1）切片中根本就不包含所預期檢查的組織或細胞。出現這種情況，要麼是病理醫生選擇錯了切片或抗體選錯了，要麼是技術員選錯了蠟塊。獲得正確的切片進行染色是獲得正確結果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術員的事，病理醫生也起著不可缺少的作用。
（2）染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修復，有的組織必須經過抗原修復才能檢測抗原表達；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環節，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB 滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。
解決陰性染色的問題非常簡單，就是設立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細胞沒有相應的抗原表達。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3 都應該有表達。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時最好選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關的抗原，如果病變出現陽性反應結果，尚能提示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術問題。因此，應另外設立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照 ”。在實際工作中需要設立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題，目前國內外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質、神經、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。
設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對照，如果沒有，就應告訴技術員采用陽性對照。因此，病理醫生在免疫組化中的作用是不可忽視的。抗體未覆蓋上測試組織：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com