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碘克沙醇梯度提取哺乳動物原代細胞過氧化物酶體

瀏覽次數:3484 發布日期:2011-2-16  來源:www.pricells.com.cn
                        碘克沙醇梯度提取哺乳動物原代細胞過氧化物酶體        

試劑和器材: 
1. OptiPrepTM(600g/L的碘克沙醇);
2. 勻漿介質:0.25mmol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、1g/L乙醇、5mmol/L 3-嗎啉基丙磺酸(MOPS),pH7.2;
3. 稀釋劑:6mmol/L乙二胺四乙酸、6g/L乙醇、30mmol/L MOPS,pH7.2;
4. 1mol/L 蔗糖溶液;
5. 按要求向勻漿介質和稀釋劑中加入蛋白酶抑制劑;
6. 使用勻漿介質制備好的線粒體組分;
7. Dounce勻漿器(10ml寬松配制,Wheaton B型);
8. 兩室梯度制備儀或Gradient MasterTM;
9. 5ml注射器(內徑大約為0.8mm),帶金屬套管針;
10. 超速離心機,配有容納30—40ml體積的固定角離心轉子,最大轉速大約為100000g,另帶大約30ml容量的厚壁管;
11. 梯度收集器;

實驗方法:
哺乳動物原代細胞培養。
原代細胞收集后,所有操作均在0—4℃進行。
1. 使用碘克沙醇、稀釋劑、1mol/L蔗糖溶液和水分別根據不同的體積比配制一下梯度溶液:500g/L碘克沙醇(5+0.6+0.4+0.0)、400g/L碘克沙醇(4+0.6+0.7+0.7)和200g/L碘克沙醇(2+0.6+1.1+2.3);
2. 使用寬松配制的Dounce勻漿器在勻漿介質中對線粒體沉淀進行重懸(研杵研磨2—3次),相應地調整使得每克組織對應0.5ml體積;
3. 使用兩室梯度制備儀或者Gradient MasterTM來制備線性梯度,使用注射器和金屬套管針從200g/L和400g/L的碘克沙醇溶液中各取9ml,制備梯度溶液并置于適用于固定角離心轉子的聚碳酸酯管中,每個梯度最底層均為2ml的500g/L碘克沙醇;
4. 在每個梯度溶液上層加入3ml混懸液,然后在105000g下離心1h;
5. 讓轉子從1000r/min開始持續減速,將梯度溶液收集于1ml中,密度越大的可越先得到收集。或者也可以用注射器和金屬套管針來收集沿梯度溶液往下2/3距離上形成帶的過氧化物酶體;

發布者:武漢原生原代生物醫藥科技有限公司
聯系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

標簽: 原代細胞
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