腫瘤早期預警的血清多肽質譜

1. 被檢查者的基本資料的收集：
1.1 被檢查者的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、職業、民族、飲食習慣等。
1.2 被檢查者的家族的遺傳史，以往的患病與治療史，過敏等情況。
1.3 被檢查者的臨床表現，包括各種體癥的表現，如發燒，疼痛等。
1.4 被檢查者的臨床影像學的表現，如核磁、CT和PET等。
1.5 被檢查者的病理切片、活檢結果、細胞學觀察、腫瘤標志物的檢測結果等臨床其它的檢測結果。

2. 血清的制備和保存：
2.1 被檢查者早上禁食，上午抽血。
2.2 采用10-20ml的一次性注射器從被檢查者的上臂的靜脈血管抽出5ml血液，抽出后，放入10ml的聚丙烯的塑料管，水平靜置，室溫30分鐘（室溫為25℃）。
2.3 在角轉頭小型離心機中于1400g，室溫，離心10分鐘。
2.4 取出上面的血清，避免取出下層的血漿，將血清分裝成100微升每小管，置于200μl的聚丙烯的塑料管中。
2.5 將裝有血清的200μl的聚丙烯的塑料管立即保存于-80℃。可保存6個月。

3. 運用磁珠對血清進行純化：
3.1  徹底渦旋混勻磁珠至少1min，以獲得均一的磁珠混懸液。
3.2  將10μl結合液和5μl樣品（如人血清）（含有的蛋白最多為500pmol）  轉移入一個標準的薄壁聚丙烯PCR管中。加入5μl混勻的磁珠，上下吹吸5次，小心混合液體。等待1min。
3.3  將PCR管置于一個磁隔離器（magnetic bead separator，MBS）內，等待20sec，以將磁珠從上清液中分離。注意管內磁珠的運動。
3.4  用移液器小心移去上清。避免槍頭和磁珠接觸，小心不要移動磁珠。
3.5  將PCR管從磁隔離器中轉移出來。
3.6  為了洗滌，加入100μl洗液。
3.7  將PCR管放入磁隔離器內，將管在臨近孔之間來回移動20次，以洗滌磁珠。
3.8  等待20sec以聚集磁珠于管壁上，用槍小心移去上清。
3.9  重復步驟6-8兩次。
3.10 在磁珠中，加入5μl乙腈（50%），徹底混勻。等待1min。（小心：乙腈  是易揮發性的，可快速蒸發�。�。
3.11 將管放置在磁隔離器內，等待30sec以將磁珠從洗脫液中分離出來，而存留在管壁上。
2.12  最后，將含有純化的多肽/蛋白質的洗脫液轉移到一個新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中。

4．純化后血清樣品的質譜分析
4.1 取1μl洗脫液加入新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中，加入10μl基質，混勻，加1μl在Anchorchip靶板上，在空氣中干燥，約5-10分鐘。
4.2 按說明書對質譜儀調整參數，用外標進行校正，然后對樣品進行分析。
4.3 軟件獲取數據，處理，得到每個樣品的質譜圖。
4.4 軟件分析，建立疾病組和正常對照組的標準譜圖，并根據差異的蛋白峰建立疾病組的特征血清多肽譜。

5．未知樣品的盲性測試
5.1 取臨床高危或普查的人群的血清，按上述方法進行資料的收集，血清的采集、保存、純化和質譜分析。
5.2 軟件分析與統計，決定其歸屬疾病或健康。
5.3 與臨床金標準如病理、細胞學等進行比較。
5.4 根據統計結果，確定未知樣品的盲性測試準確率。