正常角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

實驗材料：

1. 角膜材料：可以取自人眼、兔眼或者牛眼，人眼材料最好來自胎兒；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3. 特殊器械：虹膜恢復(fù)器；

4. 消毒液：1：5000的升汞溶液與100IU/ml的慶大霉素生理鹽水；

5. 消化液：0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合溶液；

6. 培養(yǎng)液：基礎(chǔ)液由DMEM培養(yǎng)基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO32.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。應(yīng)用液是在基礎(chǔ)液內(nèi)補加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml，并用5% NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0—7.2；

實驗方法：

1. 切取角膜內(nèi)皮層組織：以人眼為材料培養(yǎng)角膜上皮細胞時，最好取自胎兒的眼角膜。因為成年人眼角膜細胞在體外培養(yǎng)時，生長活力不如胎兒眼角膜細胞；

1） 摘取眼球1只，用升汞溶液與慶大霉素生理鹽水消毒液交替沖洗2次，以洗去眼球表面殘留的血污并作初步消毒處理；

2） 無菌條件下，于角膜緣內(nèi)側(cè)1mm處作一環(huán)形小切口；

3） 用虹膜恢復(fù)器從切口處插入后彈力膜與角膜基質(zhì)（實質(zhì)層）之間，順角膜弧度鈍性分離去除整個角膜實質(zhì)層；

4） 待角膜上皮層被完全分離之后，沿角鞏膜緣內(nèi)側(cè)1mm處環(huán)形剪下全周內(nèi)皮層組織；

2. 接種與培養(yǎng)；

1） 將所取的內(nèi)皮層組織放在培養(yǎng)皿中，加入2—3滴牛血清；

2） 用角膜剪將其剪成約1.5mm×1.5mm大小的組織塊；

3） 用無齒小鑷子將組織塊內(nèi)皮面朝下平貼接種于培養(yǎng)瓶中；

4） 在培養(yǎng)箱中靜置20—60min，待植塊牢固黏附后，再加入足量培養(yǎng)液；

5） 按常規(guī)方法培養(yǎng)。每周換液2次；