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表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）技術也即蛋白指紋圖譜技術是近幾年發展起來的實驗室診斷新技術。
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表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）技術也即蛋白指紋圖譜技術是近幾年發展起來的實驗室診斷新技術。近年來，該技術在差異表達蛋白質組學，蛋白質相互作用及疾病檢測方面得到了廣泛的應用，尤其適合多肽及低分子量蛋白質譜分析的研。
一、實驗目標
以蛋白質芯片SELDI系統為載體，通過對目標疾病組及正常對照組之間進行鑒定，以期找到能夠區分不同組別的差異峰，并通過對差異峰進行蛋白質鑒定，期望找到與目標疾病密切關聯的基因/蛋白。
二、實驗方案
2.1．樣品準備
采集臨床病人及正常人血清，并做好臨床資料的收集。采樣數量大于100例，一般情況下病人樣品與正常人樣本相等，也可以病人樣品略多于正常人。
采集患者術前血和正常對照外周靜脈血立即放入4℃冰箱，過夜后3000r/min離心15分鐘，取血清，20ul一管分裝后置于-80℃冰箱保存。
2.2. 芯片實驗及進度
芯片采用伯樂公司的WCX2蛋白質芯片。分為三個階段：
預實驗階段：對相關的實驗條件進行摸索，確定最佳的實驗參數，需花時2周左右；
正式實驗階段：對樣品進行實驗操作，得到質譜圖，需花時4周左右；
數據分析階段：對實驗得出的原始質譜數據進行分析，分析項目包括原始數據的分布情況分析、差異峰的篩選、聚類分析、主成分分析（PCA）、疾病預測模型的構建及差異峰所對應的蛋白的生物信息學鑒定六個項目，以充分挖掘原始數據中有價值的信息。花時2周左右。
2.3. 蛋白質鑒定
對差異峰所對應的蛋白(預測）進行實驗驗證。采用的實驗方法為Western鑒定。我們對差異蛋白進行精選，挑選兩個蛋白進行western實驗，實驗中用到的蛋白質抗體由客戶提供。另外，需要提出的是，由于實驗具有一定有不確性定，所以我們不保證該實驗結果的準確性。但如果一旦發現目標蛋白，這結果將是一篇很好的SCI論文。時間為1-2個月
三、實驗步驟
SELDI蛋白質芯片實驗包括四個步驟：
步驟一：芯片類型的選擇
蛋白質芯片提供了多種色譜的功能，包括親水、疏水、陽離子交換、陰離子交換以及金屬親和表面等。此外，通過共價偶聯選定的蛋白質或者其他目標分子，可以對芯片表面實現預活化，從而設計出具有更高針對性、特異性的芯片。
步驟二：上樣
血清、細胞或者組織的裂解液、尿、腦脊液，或者其他蛋白質勻漿液等復雜的生物學樣品——包括那些含有高濃度鹽離子和去垢劑的樣品——都可以直接上樣于SLEDI蛋白質芯片表面。樣品通過手工加樣或者自動上樣儀進行點樣。復雜蛋白質樣品中的一個特定亞群將通過簡單的化學作用或者蛋白質相互作用被芯片捕獲。
步驟三：未結合成分的洗脫
孵育后，未結合的蛋白和其他成分從芯片表面洗脫掉。只有那些特異性結合的蛋白質才保留下來用于進一步的分析。這種選擇性的洗脫進一步選取基于芯片特色的蛋白質集合。
步驟四：在SELDI蛋白質閱讀機上進行分析
在洗脫步驟之后，點加上含有能量吸收分子（EAM）的有機溶液。EAMs對樣品的離子化起關鍵作用。在蛋白質溶解到含有EAM的溶液之后，溶液揮發掉，在芯片表面形成蛋白質和EAMs的共結晶。
芯片在SELDI閱讀機上進行分析，后者是一種時間飛行質譜。芯片閱讀機內有一個氮源的激光器，導致離子化和解吸附過程的產生。激光能量誘導蛋白質離子化以及從晶體態到氣態的轉變。
一旦進入到氣態，帶電蛋白質分子在一個分離電壓作用下迅速地運動，或稱“飛行”。分離電壓對樣品中所有的分子具有相同的作用，使之表現出基于分子量差別的不同飛行時間。SELDI閱讀機記錄下這些飛行時間，換算成分子量。
四、數據分析方案
1、數據預處理
原始數據經相關軟件處理，設置第一步S/N>5,第二步S/N>2，得到peak cluster數據。以此數據進行了后續的分析。
2、差異peak篩選
利用wilcoxon sum rank test統計檢驗，我們檢驗了每個peak在組份中中值的差異。
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peak_index
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M/Z
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AVG_case
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STD_case
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AVG_control
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STD_control
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p-value
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M2047_35
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2047.35
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1.1237
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1.9139
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4.2743
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3.1970
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0.0000
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…
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…
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…
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…
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…
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…
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…
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3、層次聚類
對所有表達差異峰（peak）進行聚類，確定差異峰及不同樣品之間的互作關系，一般認為在聚類圖上距離越近的樣品或差異峰之間的關系越密切。
4、PCA分析（principal component analysis）
通過對有顯著性差異的peak做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低維度空間反映樣品之間的關系。用score plot展示PCA分析結果.
5、疾病預測模型的構建
利用決策樹，Bayesian network, ANN及SVM等機器學習語言對芯片結果進行預測模型的構建，將部分芯片數據拿來做預測模型，然后部分芯片數據作為測試數據集（獨立樣本）來驗證模型的準確性。
目的在于利用實驗數據來篩選出一批靶標基因，并以此構建模型，以進行早期診斷、疾病預測和預后分析。
6、差異峰關聯蛋白鑒定
為了進一步的對其進行鑒定，需要找到這些差異峰(peak)對應的蛋白質或基因。為了解決這個問題，我們根據相關SCI文獻的算法構建一個軟件peak2gene，用于對實驗中找到的差異峰所對應的蛋白進行生物信息學鑒定。以便于客戶進一步的利用RT-PCR，western等實驗方法對感興趣的目標蛋白進行鑒定。
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