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Realtime-PCR（熒光定量PCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通常可以分為熒光探針和熒光染料兩種。
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理論支持：
Realtime-PCR（熒光定量PCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。通常可以分為熒光探針和熒光染料兩種：
（1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。
（2）SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
服務內容：
1、目的基因表達的定性和定量分析（相對定量和絕對定量）；
2、基因芯片的結果驗證；
具體操作：
一、定性分析：
1、將得到的樣品（組織或細胞）進行RNA提取，并反轉錄成cDNA（必須設立陰性對照和陽性對照，操作同樣品）；
2、進行Real-time檢測（操作同下）；
二、定量分析：
（一）相對定量
1、將得到的樣品（組織或細胞）進行RNA提取，并反轉錄成cDNA（必須設立陰性對照和陽性對照，操作同樣品）；
2、分別選取陰性對照、陽性對照及部分樣品為模板，采用內參和目的基因的引物（一般為b-actin和GAPDH）進行普通PCR，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，明確擴增產物的特異性；
3、Real-time檢測：
（1）如采用SYBR熒光染料，為每一樣品分別設立內參組和目的基因組，各為三復孔；如采用熒光探針，可在同一孔內進行內參和目的基因的表達，設立三復孔；
（2）加樣后上機檢測，并完成融解曲線的檢測；
（3）分析結果：溶解曲線分析引物特異性；
根據ct值計算相對定量值；
（二）絕對定量
1、將得到的樣品（組織或細胞）進行RNA提取，并反轉錄成cDNA（必須設立陰性對照和陽性對照，操作同樣品）；
2、分別選取陰性對照、陽性對照及部分樣品為模板，采用內參和目的基因的引物（一般為b-actin和GAPDH）進行普通PCR，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，明確擴增產物的特異性；
3、Real-time檢測：
（1）檢測各樣品的內參，以調整各樣本DNA總量達到一致；或通過紫外分光光度法測定DNA的含量，調整DNA總量達到一致；
（2）將標準品按梯度稀釋后，進行目的基因的檢測，制備ct值和目的基因拷貝數相互關系的標準曲線；
（3）將樣品進行目的基因的檢測后，根據標準曲線計算目的基因的含量；
（3）分析結果：溶解曲線分析引物特異性；
根據ct值計算目的基因的定量值；
三、基因芯片結果驗證
1、將得到的樣品（組織或細胞）進行RNA提取，并反轉錄成cDNA（必須設立陰性對照和陽性對照，操作同樣品）；
2、進行相對或絕對定量分析，明確目的基因表達的改變；
客戶須知：
1、本公司采用SYBR的檢測試劑購自TaKaRa，如客戶使用探針，建議從TaKaRa或Invitrogen公司定購；
2、本公司的Real-time儀能夠同時在1個孔中檢測四個指標；
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