蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心｡ 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白,并表明蛋白質譜不是穩定的,而是隨環境而變化｡ 雙向電泳原理簡明,第一向進行等電聚焦,蛋白質沿pH梯度分離,至各自的等電點;隨后,再沿垂直的方向進行分子量的分離｡ 目前,隨著技術的飛速發展,已能分離出10000個斑點(spot)｡ 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候,蛋白質組的分析變得可行｡

樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效,目標是盡可能擴大其溶解度和解聚,以提高分辨率｡ 用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯合有協同作用｡ 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解､變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質｡

 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理｡ 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換｡三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵,增強了蛋白的溶解度,并導致轉至第二向的增加]｡ 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度,作為互補試劑會更有效｡

 在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA)｡ 除此之外,機械力被用來對蛋白分子解聚,如超聲破碎]等｡ 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制劑,可保持蛋白完整性｡ 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的,可在其水化的過程中加樣,覆蓋整個IPG膠,避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失]｡ 此外,低豐度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能,代表蛋白質組研究的“冰山之尖”,故分離低豐度蛋白是一種挑戰｡

亞細胞分級和蛋白質預分級､提高加樣量(已達到1~15 mg級的標準)､應用敏感性檢測,可以提高其敏感性｡ 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測｡ 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點｡ 由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生,對PI(等電點)超過10的堿性蛋白,通過產生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之｡ 亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性｡

 服務內容:

1､雙向電泳樣本制備與定量;

2､雙向電泳與圖片分析;

3､雙向電泳實驗報告提交｡

實驗報告:

1､雙向電泳電子圖片及定量分析結果,包括差異點號碼､差異倍數;

2､雙向電泳完整的實驗步驟､使用儀器､軟件檢索參數等