tRNA是基因與蛋白之間重要的信息傳遞者，通過與特定氨基酸結(jié)合而發(fā)揮功能。越來越多的文獻(xiàn)表明，tRNA及其來源的RNA片段（tRFs）在細(xì)胞增殖、分化、代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病中發(fā)揮著調(diào)控作用^[1]。tRNA攜帶種類豐富、數(shù)目眾多的轉(zhuǎn)錄后修飾。這些修飾為tRNA功能發(fā)揮所必需，參與tRNA的正確折疊，穩(wěn)定維持和基因解碼功能。比如，位于頸環(huán)部位的修飾影響tRNA的折疊與穩(wěn)定性，反密碼子環(huán)上的修飾確保翻譯準(zhǔn)確性，34號(hào)位置的修飾決著密碼子的擺動(dòng)性，反密碼子環(huán)附近的修飾調(diào)控密碼子與反密碼子識(shí)別（圖1）。
    tRNA修飾受各類tRNA修飾相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)調(diào)控^[2]，這些蛋白突變或者功能紊亂，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，NSUN2負(fù)責(zé)催化胞嘧啶5’甲基化，其突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體頭小畸形癥^[3]；t6A甲硫基轉(zhuǎn)移酶CDKAL1功能紊亂可誘發(fā)Ⅱ型糖尿病^[4]。tRNA修飾對(duì)于疾病治療的重要性，以及這些修飾是如何被調(diào)控，仍待進(jìn)一步的研究^[5,6]。

圖1. 人類tRNA修飾類型與修飾相關(guān)蛋白。

      美國(guó)Arraystar公司最新發(fā)布了市場(chǎng)上首款聚焦tRNA修飾蛋白檢測(cè)的PCR芯片 ——NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR Array。參考已有文獻(xiàn)與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt和Modomics），此款芯片囊括了85個(gè)tRNA修飾酶和蛋白因子，覆蓋了所有已知的tRNA修飾酶。PCR芯片上的每對(duì)引物在多個(gè)組織和細(xì)胞系中通過了嚴(yán)格驗(yàn)證。

產(chǎn)品信息：

芯片特點(diǎn)：
• 覆蓋度廣—囊括了UniProt與Modomics中所有已知的tRNA修飾酶/蛋白因子
• 嚴(yán)謹(jǐn)性強(qiáng)—所有引物都通過了多樣本嚴(yán)格驗(yàn)證
• 快速簡(jiǎn)易—即用型384孔板規(guī)格，只需將cDNA與qPCR Master Mix混合試劑加入PCR板中，4小時(shí)內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。cDNA無需預(yù)先擴(kuò)增。

表1.tRNA修飾酶/蛋白因子（修飾類型）

注：tRNA修飾縮寫參考Modomics數(shù)據(jù)庫(kù)，基因名參考UniProt。

PCR芯片實(shí)驗(yàn)流程
1. RNA抽提與質(zhì)量檢測(cè)
進(jìn)行RNA常規(guī)抽提，使用NanoDrop ND-1000檢測(cè)RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度和完整性。詳細(xì)的樣品QC結(jié)果見Arraystar服務(wù)報(bào)告。
2. cDNA合成
每樣本取1.5 μg RNA，使用rtStar™ First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 試劑盒合成cDNA第一鏈。詳細(xì)步驟參照Arraystar產(chǎn)品操作手冊(cè)。
3. Real-time PCR擴(kuò)增
將cDNA與 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合，加入至384孔板中，在ABI 7900 PCR儀上進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。
4. 熔解曲線分析與原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出
PCR擴(kuò)增完成后，進(jìn)行熔解曲線分析，使用PCR儀自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)。出具Raw Data文件夾，包含原始Ct值、PCR擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線圖。

PCR芯片數(shù)據(jù)分析流程
1. PCR芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控
質(zhì)控參數(shù)：Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述條件的樣本進(jìn)入下一步分析。
2. 數(shù)據(jù)校正與△Ct值計(jì)算
板間校正：使用Ct(PPC)對(duì)不同PCR板進(jìn)行板間校正。
內(nèi)參校正與△Ct值計(jì)算：挑選最優(yōu)內(nèi)參，使用內(nèi)參均值計(jì)算△Ct值。
3. 差異倍數(shù)計(jì)算 (2^(-△△Ct))
使用 △△Ct 方法計(jì)算不同樣品組之間的表達(dá)差異倍數(shù)。
4. P值計(jì)算
對(duì)樣本組進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算P值。
5. 其他常規(guī)數(shù)據(jù)分析
散點(diǎn)圖分析；火山圖分析；TOP20表達(dá)上調(diào)和下調(diào)transcript柱形圖分析
6. 提供服務(wù)報(bào)告與數(shù)據(jù)分析結(jié)果
a. Arraystar服務(wù)報(bào)告（包括RNA樣本QC和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析步驟）
b. Excel芯片結(jié)果匯總表（包括Transcript列表，數(shù)據(jù)分析結(jié)果和各類圖表）
c. Raw Data文件夾 (包含原始數(shù)據(jù)、擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線圖)

NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR芯片服務(wù)部分結(jié)果展示
1. 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本列表（默認(rèn)篩選參數(shù)：差異倍數(shù)>2；P<0.05，客戶可指定篩選參數(shù)值）

2. 散點(diǎn)圖 (黑色斜線代表差異倍數(shù)為1，紅色斜線代表差異倍數(shù)為2)

3. 火山圖（黑色垂線代表差異倍數(shù)為1；粉色垂線代表上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)為2；藍(lán)色水平線代表P值為0.05）

4. TOP20表達(dá)上調(diào)transcript柱狀圖

5. TOP20表達(dá)下調(diào)transcript柱狀圖

參考文獻(xiàn)：
[1] Kirchner S, Ignatova Z. Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease. Nature reviews Genetics 2015;16:98-112.
[2] El Yacoubi B, Bailly M, de Crecy-Lagard V. Biosynthesis and function of posttranscriptional modifications of transfer RNAs. Annual review of genetics 2012;46:69-95.
[3] Blanco S, Dietmann S, Flores JV, Hussain S, Kutter C, Humphreys P, et al. Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neuro-developmental disorders. The EMBO journal 2014;33:2020-39.
[4] Zhou B, Wei FY, Kanai N, Fujimura A, Kaitsuka T, Tomizawa K. Identification of a splicing variant that regulates type 2 diabetes risk factor CDKAL1 level by a coding-independent mechanism in human. Human molecular genetics 2014;23:4639-50.
[5] Zhang X, Cozen AE, Liu Y, Chen Q, Lowe TM. Small RNA Modifications: Integral to Function and Disease. Trends in molecular medicine 2016.
[6] Suzuki T, Nagao A, Suzuki T. Human mitochondrial tRNAs: biogenesis, function, structural aspects, and diseases. Annual review of genetics 2011;45:299-329.

上海康成生物工程有限公司自2002年起專注于生物科研技術(shù)服務(wù)，是國(guó)內(nèi)最早一批專業(yè)提供生命科學(xué)前沿研究技術(shù)服務(wù)的高科技企業(yè)。為進(jìn)一步拓展在醫(yī)學(xué)科研服務(wù)領(lǐng)域業(yè)務(wù)的深度和廣度，向多譜領(lǐng)域發(fā)展，重塑品牌 Aksomics（數(shù)譜生物）。Aksomics全面整合公司在非編碼RNA（lncRNA、circRNA、small RNA等）、表觀遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)等檢測(cè)方向的核心技術(shù)，依靠自身優(yōu)秀的研發(fā)、技術(shù)、營(yíng)銷和服務(wù)團(tuán)隊(duì)，憑借國(guó)際領(lǐng)先的技術(shù)平臺(tái)和高標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控體系，形成了涵蓋表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域的一站式技術(shù)平臺(tái)。

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