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熱點(diǎn)實(shí)驗(yàn)服務(wù):CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)案例介紹
嘉美生物提供CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)
服務(wù)類別:免疫與抗體總訪問:1173
最后更新:2015-5-20半年訪問:2
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熱點(diǎn)實(shí)驗(yàn)服務(wù):CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)案例介紹

背景:真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在,研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。與傳統(tǒng)的EMSA技術(shù)相比,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)能真實(shí)完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白,是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的最佳方法。
原理:是在活細(xì)胞狀態(tài)下以甲醛固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,超聲將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后加入目的蛋白抗體,通過抗體沉淀靶蛋白-DNA復(fù)合物,通過洗脫的方法得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)(PCR分析),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
應(yīng)用:1.組蛋白修飾研究 2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析 3.藥物開發(fā)研究 4.有絲分裂研究 5.DNA損傷與凋亡分析。
步驟:
      1)甲醛處理細(xì)胞
      2)收集細(xì)胞,超聲破碎
      3)加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合
      4)加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,沉淀
      5)對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗,除去一些非特異性結(jié)合
      6)洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物
      7)解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷
      8)PCR或基因芯片分析。    

             
實(shí)驗(yàn)案例              證明C/EBP與Tmub1啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列的結(jié)合

 

實(shí)驗(yàn)背景:在IL-6誘導(dǎo)條件下,利用CHiP技術(shù)提取C/EBP-DNA復(fù)合物,以Tmub1基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物,以提取的DNA為底物,進(jìn)行擴(kuò)增,從而證明C/EBP結(jié)合的DNA含有Tmub1基因,進(jìn)一步確認(rèn)C/EBP與Tmub1啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列的相互作用。
實(shí)驗(yàn)分組:分2個(gè)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)普通PCR檢測(cè)和WB檢測(cè)(檢測(cè)Tmub1蛋白表達(dá)水平,抗體嘉美生物實(shí)驗(yàn)室提供。注:嘉美生物實(shí)驗(yàn)室提供絕大多數(shù)常用國外原裝進(jìn)口抗體,為實(shí)驗(yàn)委托者節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。)
第一組:A組 
第二組:B組 
轉(zhuǎn)染3天后收集細(xì)胞做CHIP-PCR以及WB檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)對(duì)照:設(shè)定的對(duì)照有

      1、陽性對(duì)照(系統(tǒng)陽性對(duì)照,Anti-RNA Polymerase II)
      2、INPUT對(duì)照(DNA片段在沉淀以前,收集下來的對(duì)照)
      3、陰性對(duì)照(非免疫IgG血清吸附,Normal Mouse IgG)
細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程:

 

     EZ-ChIP™染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)流程(Upstste Catalog # 17-371)

 

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟,請(qǐng)見下面鏈接:

http://www.jiamay.net/vshow_28_2031.html

 

 

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