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利用單倍體育種是克服雜種分離,提高獲得純和材料的效率,縮短育種年限的有效手段。花藥離體培養獲得單倍體育種在實踐中得到應用,武漢雙螺旋生物科技有限公司對油菜花藥離體培養已具備一定成熟的經驗。
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利用單倍體育種是克服雜種分離,提高獲得純和材料的效率,縮短育種年限的有效手段。花藥離體培養獲得單倍體育種在實踐中得到應用,油菜花藥離體培養已具備一定成熟的經驗。
油菜花藥培養的方法及程序:
油菜花藥培養的方法有幾種,但以液體添浮分步培養法效果較好。培養基為keller改良B
1.花的采摘及小孢子發育時期檢驗 采收花蕾長1-1.5毫米的主花序3-10厘米作為材料,剪除不不合要求部分,用紗布包好,放入有標記(寫明材料來源)的小燒杯中,加入少量清水。用醋酸洋紅或PICCH染色液染色,觀察小孢子發育時期,在小孢子發育為早核早期(即單核靠邊期)培養及為理想,是小孢子啟動的最佳期,容易進行分裂二形成細胞團,這是形成胚狀體的先決條件。
2.預處理 把選擇好的材料進行低溫預處理,放在8-10攝氏度的陰暗處5-8天,以提高胚狀體誘導率,一直仿繡體形成,出發小孢子進行異化發育,從而形成二個貌似的核,產生第一次有絲分裂。預處理的作用在于小孢子保持較強的生活力,延遲衰老和防止花粉敗育,增加可用活化花粉數。
3.材料的滅菌 將花序在70%的酒精中迅速浸一下,取出放在0.1%升汞(或飽和漂白粉)溶液,浸泡10f分鐘,取出后在超凈工作臺上剝取花藥。
4.接種 在超凈工作臺上進行無菌剝蕾、取藥,注意保留好花藥,傷損者剔除,種在改良B。液體培養基上進行懸浮培養,培養過程如下:
(1)高濕暗培養:培養時間在2-3天,這階段是小孢子啟動分列前期,瓷器的特點是粉壁變薄并開始分裂,分列式均等的,兩個子核子在形態上十分相似,這是高濕處理十微管溶解,紡錘體解體的異變分裂的結果。
(2)常溫暗培養:培養時間在7-10天,這階段的作用在于為形成胚狀體創造最佳條件,適合細胞分裂。此期的特點是前期在鏡下可見到細胞團,后期出現小胚狀體,這期間更換1-2次培養基。
(3)常溫光培養:出現胚狀后立即轉移至光下進行培養,這階段是黃色胚狀體見光后變為綠色,繼而發育成小植株。此階段把形成胚狀體的部分移至B。固體培養基或用1/2MS培養基。糖的濃度降至2%。這階段應保證溫度、光熱及通氣等條件,經常更換培養基,保證其順利發育。發育的過程一般是先長出不定形葉,繼而長出芽點,然后形成正常的單倍體植株。
5.鍛煉及成苗 把長出正常植株的三角瓶瓶口打開,在光下鍛煉1-2周,取出幼苗,洗凈培養基,移苗至培養體中,放在適宜的條件下進行成苗培養。
6.染色體的檢驗 取幼苗進行鑒定,用對二氯苯飽和水溶液預處理4小時,然后固定24小時,通過95%-50%的遞降乙醇液,用清水沖洗,放入1N鹽酸中浸5-10分鐘,換入新的1N鹽酸液在60攝氏度的水浴中離解10分鐘,過一下涼的1N鹽酸,在錫夫氏試劑中染色過夜,用漂洗液漂凈,然后水洗,最后在PICCH染色液或45%的醋酸中壓片,在顯微鏡下鑒定染色體數目。
7.染色體加倍 用0.05%的秋水仙素進行根系浸泡24小時,用水沖洗干凈,定植在田圃。