問(wèn)題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果移碼）

圖1-1


圖1-2

 

解決方法：將PCR 產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T 載體）中挑單克隆測(cè)序，或?qū)�PCR 產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序。問(wèn)題圖2（PCR 產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長(zhǎng)度不一）

圖2

 

解決方法：主要原因是PCR 產(chǎn)物沒(méi)有純化，含有部分序列一致的兩種以上長(zhǎng)度不一的片段，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行PAGE 純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測(cè)序，便可解決。

 

問(wèn)題圖3（測(cè)序引物有堿基缺失）

 

測(cè)序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1 有些類(lèi)似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測(cè)序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話(huà)，則從測(cè)序一開(kāi)始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開(kāi)始就是嚴(yán)重的峰形重疊。

解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁�物進(jìn)行PAGE 純化（注：好多公司雖然稱(chēng)提供的引物為PAGE級(jí)，但是，嘿嘿……）

2、克隆測(cè)序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊

原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測(cè)序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測(cè)序的菌液污染。
 

解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線(xiàn)分離單菌落），提質(zhì)粒或送菌液再次測(cè)序。

3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)

模板中有雜合型突變，也就說(shuō)模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來(lái)的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。
 

解決方法：建議將DNA 片段克隆到載體再測(cè)序。
 

4、polyA/T 和C/G cluster 導(dǎo)致的套峰和測(cè)序信號(hào)衰減
 

圖4-1

圖4-2

略（太大無(wú)法上傳，刪除部分圖片）

圖4-3

圖4-4

RACE 測(cè)序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1 和圖4-4 的情形，解決方法：從另一端測(cè)序；但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間，呵呵，目前還沒(méi)有很好的解決方法，要看測(cè)序公司的本事了。C/G cluster 在PrV 基因組測(cè)序時(shí)遇到過(guò)。后來(lái)還是讓TaKaRa 公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時(shí)候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服務(wù)。

 

5、基因中含有重復(fù)序列

可能的原因: 樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果和PolyA/T 的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致Frame 滑動(dòng)，較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長(zhǎng)的重復(fù)序列會(huì)使定序信號(hào)衰減。

解決辦法: 反向測(cè)序有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復(fù)序列區(qū)域(但不是一定都能夠)，通過(guò)多次的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，拼接可以得到全序列結(jié)果。