一年前的今天
華人科學界的各個圈子都在為一條消息而驚愕和惋惜。

錢永�。�1952-2016）來源：wiki

2008年諾貝爾化學獎得主、美籍華裔科學家錢永�。≧oger Tsien），于2016年8月24日在美國俄勒岡州尤金縣去世，享年64歲。加州大學圣迭戈分校的訃告上寫道：“錢永健教授的工作照亮了科學”。的確，在綠色熒光蛋白的發展史上，錢永健占了濃墨重彩的一筆，他成功改造了綠色熒光蛋白，并拓展了綠色以外的其他顏色熒光蛋白，使熒光蛋白的應用得到了極大的普及，為同時追蹤多種生物細胞變化的研究奠定了基礎。如今發表的生物醫藥領域科研成果有一半以上都用了這一技術。

紀念錢永�。禾觳艑W霸的人生

錢永健1952年出生于美國紐約，在新澤西州利文斯頓長大。錢永健的家族可謂是“科學世家”，出了多位科學家和工程師。他是中國著名科學家錢學森的堂侄。

錢永健小時候患有哮喘，只能經常待在家里。他對化學實驗感興趣，常常在家中地下室里做化學實驗，一做就是幾個小時。他8歲時的實驗記錄本如今被收藏在瑞典斯德哥爾摩的諾貝爾博物館中。

16歲時，錢永健獲得生平第一個重要獎項，也是美國授予高中生完成科研項目的最高獎：西屋科學天才獎，當時他研究的是金屬如何與硫氰酸鹽結合。

上圖：時任美國總統尼克松祝賀獲得西屋天才獎一等獎的錢永健

錢永健后來獲得美國國家優等生獎學金進入哈佛大學學習，20歲獲得化學物理學士學位并前往劍橋大學深造，后獲生理學博士學位。他于1989年起在加州大學圣迭戈分校工作，至今已有27年。

錢永健去年8月24日單獨騎車后沒有回家，被找到時已經去世。世人猜測錢永健是在騎自行車時去世的。

錢永健生前樂衷自行車運動

他的工作“點亮了科學”

錢永健一生獲獎無數，幾乎囊括所有生命科學領域大獎，也是唯一一位華人沃爾夫獎和諾貝爾獎“雙得主”。是美國國家科學院院士、美國國家醫學院院士、美國藝術與科學院院士。而其年少成名，更是當之無愧的少年天才。

著名生物學家饒毅曾寫道：“錢永健的工作，從上世紀八十年代一開始就引人矚目。他可能是世界上被邀請作學術報告最多的科學家，因為化學和生物界都愛聽他的報告，既有技術應用，也有一些很有趣的現象……很多人認為錢永健會得諾貝爾獎，可以是化學獎，也可以是生理學與醫學獎�！�

得益于嚴謹的家教，人們印象中的錢永健總是謙遜、低調、誠懇�？磫栴}的眼光獨到、犀利，對科學研究充滿熱情和專注，對學生和同事慷慨無私。

會發光的蛋白GFP

20世紀后期，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為代表的一系列生物熒光標記蛋白的發現與應用，為生物學的大發展提供了一種全新的工具。自此之后，科學家們能夠很方便地觀察到活細胞的細微結構和生理過程，之前難以觀察及研究的例如胚胎的發育過程、癌細胞的擴散方式等，如今變得輕而易舉。

綠色熒光蛋白（GFP）的形狀就像一個圓柱體
來源：圣迭戈大學錢永健實驗室

綠色熒光蛋白不僅無毒，而且不需要借助其他輔酶，自身就能發光，可以讓科學家在分子水平上研究活細胞的動態過程。當綠色熒光蛋白的基因和我們感興趣的有機體內所擬研究的蛋白質基因相融合時，蛋白質既能保持其原有的活性，綠色熒光蛋白的發光能力也不受影響。通過顯微鏡觀察這種發光的“標簽”，科學家就能做到對蛋白質的位置、運動、活性以及相互作用等一目了然。在一個活體中有數萬種不同的蛋白質，這些蛋白質精細地控制著重要的化學進程。如果蛋白機制發生故障，通常就會發生疾病。綠色熒光蛋白可幫助研究這類機制，這就是為什么綠色熒光蛋白成為生物科學極其重要的工具。在它的幫助下，科學家還能對各種細胞的命運了如指掌，比如，腦神經細胞是如何發育起來的，或者癌癥細胞是如何擴散的……

徠卡雙光子四維成像的斑馬魚胚胎的Expression of cytoplasmic GFP in the notochord and prechordal plate, 980nm. Nuclei stain through RNA injection H2B-mCherry @1030 nm. Courtesy of BioEmergences USR3695 (IBiSA FBI), Gif sur Yvettes, France.

連續33h的小鼠胚胎異染色質的形成需要關鍵的組蛋白變體H3.3，表達的EGFP。攝自Leica活細胞工作站DMi8。

通體表達GFP發出綠色熒光的小鼠，攝自Leica體視鏡M205FA。

由于使用傳統熒光染料有深層組織標記困難、難以用于活體標記、長時間成像易淬滅等瓶頸，所以在熒光蛋白家族出現之前，以上這些活體深層成像，長時間活細胞成像的實驗效果，都是使用傳統熒光染料所無法想象的。使用熒光蛋白對活體標本進行示蹤，為傳統生物學研究帶來了嶄新的實驗方法，使多個生物領域一躍進入了活體動態過程的定量研究階段。

熒光蛋白現在廣泛應用于生物學研究。可以通過常規的基因操縱手段，將熒光蛋白用來標記其他目標蛋白，這樣可以觀察、跟蹤目標蛋白的時間、空間變化。提供了以前不能達到的時間和空間分辨率，而且可以在活細胞、甚至活體動物中觀察到一些分子。熒光蛋白技術也使得人們可以研究某些分子的活性，而不僅僅是其存在與否。

對于有些研究來說，熒光蛋白的作用可以形容為“起死回生”：原來有些方法，需要把生物變成死物才能研究一些現象和過程，而熒光蛋白為主要支柱之一的現代成像技術，使科學家在活的細胞中觀察和研究這些過程，使一部分“死物學”變成“生物學”。

2008年的諾貝爾化學獎

正因為GFP家族如此巨大地改變了生命科學的研究進程，瑞典皇家科學院將2008年的諾貝爾化學獎授予對GFP的發現、表達和開發做出了杰出貢獻的三位科學家：下村修(Osamu Shimomura,1928-)、馬丁·查爾菲(Martin Chalfie,1947-)和錢永健(Roger Yonchien Tsien,1952-2016)。

上圖從左至右分別為：美國科學家馬丁·查爾菲（Martin Chalfie）任職于哥倫比亞大學、日本科學家下村修（Osamu Shimomura）當時任職于美國Woods Hole海洋生物學實驗室（MBL）、美籍華裔科學家錢永健（Roger Y. Tsien），任職于加州大學圣迭戈分校

下村修首次從Aequorea victoria中分離出GFP。他發現該蛋白在紫外線下會發出明亮的綠光。 

Martin Chalfie證明了GFP作為多種生物學現象的發光遺傳標記的價值。在最初的一項實驗中，他用GFP使秀麗隱桿線蟲的6個單獨細胞有了顏色。 

錢永健的主要貢獻在于讓人們理解了GFP發出熒光的機制。同時，他拓展出綠色之外的可用于標記的其他顏色，從而使科學家能夠對各種蛋白和細胞施以不同的色彩。這一切，令在同一時間跟蹤多個不同的生物學過程成為現實。 

實際上，從綠色熒光蛋白的發現到熒光蛋白標記法的發明應用，過程相當復雜�？梢哉f，如果沒有眾多科學家接力，GFP的火把就不會成功穿越間隔在發現與發明之間漫長的“黑暗”，熒光蛋白標記法就不可能獲得普及。

在GFP發現和普及過程中的幾個關鍵人物。其中下村修，查爾菲和錢永健獲得2008年諾貝爾化學獎。

下村修：阿甘一樣的執著和快樂

說到GFP，毫無爭議的發現者是日本科學家下村修（Osamu Shimomura，下村脩）和已故美國科學家約翰森（Frank H. Johnson,1908-1990）。他們1961到1974年發現兩種發光的蛋白質：水母素（aequorin）和GFP。

1962年，下村修和約翰森等在《細胞和比較生理學雜志》上報道，他們分離純化了Aequorea victoria水母中發光蛋白水母素。據說下村修用水母提取發光蛋白時，有天下班要回家了，他把產物倒進水池里，臨出門前關燈后，回頭看一眼水池，結果見水池閃閃發光。因為養魚缸的廢水也流到同一水池，他懷疑是魚缸排出的成分影響水母素，不久他就確定鈣離子增強水母素發光。1963年，他們在《科學》雜志報道鈣和水母素發光的關系。

1962年下村修和約翰森那篇純化水母素的文章中，有個注腳，說還發現了另一種蛋白，它在陽光下呈綠色、鎢絲燈下呈黃色、紫外光下發強烈綠色。其后他們仔細研究了其發光特性。1974年，他們得到了這個蛋白，當時稱綠色蛋白、以后稱綠色熒光蛋白（GFP）。Morin和Hastings提出水母素和GFP之間可以發生能量轉移。水母素在鈣刺激下發光，其能量可轉移到GFP，刺激GFP發光。這是物理化學中已知最早的熒光共振能量轉移(FRET)在生物中的發現。

下村修當時并沒有料到，自己不經意間發現的GFP后來竟成了科學家們深入揭示生命活動奧秘的一個非常重要的工具。

下村修的童年少年時光都是在戰亂中度過的。戰后初期，他在長崎醫科大學（長崎大學前身）附屬藥學�？撇客瓿闪巳�年的高等教育，（嗯，就是原子彈爆炸的那個長崎。原子彈在他16歲時爆炸，他曾數周失明。）1955年，下村被選派到名古屋大學理學院化學系天然有機化學研究室進修。在那里，他對發光海螢(Cypridina hilgendorfri)體內的熒光素提取出來并獲得結晶，并為最終確定熒光素的分子結構奠定基礎。由于此項工作在當時難度極大，普林斯頓大學哈維(Newton Harvey,1887-1959)教授帶著學生干了好多年仍未取得成功。于是，引起了哈維的弟子——普林斯頓大學生物學系教授約翰遜(Frank Johnson,1908-1990)的注意，他盛情邀請剛被名古屋大學破格授予理學博士學位的下村于1960年9月來到普林斯頓，開始從事為期三年的關于多管水母(Aequorea victoria)的博士后研究。

下村修在演講中展示的水母圖片
其中下左圖為日光狀態、下右圖為黑暗中狀態

他們提取到了5毫克高純度多管水母發光物質，對其進行分析后發現，該發光物質確實是一種蛋白質，加微量鈣離子后會發藍光，而且在真空狀態下也能發光。下村等人將這種特殊蛋白質命名為“aequorin”，即水母素。在純化水母素過程中，下村等人還發現了一個副產品——一種含量很低、在自然光的照射下發淺綠色熒光的新型蛋白質。于是，在該年投給《細胞和比較生理學學報》的論文腳注中，下村等人首次公開了這項發現。當時，他們將這種新型蛋白質稱為“綠色蛋白質”，也就是今天的GFP。

加微量鈣離子后會發藍光的“綠色蛋白質”
來源：下村修演講報告

1963年初，下村修和約翰遜等把水母素對鈣離子敏感的相關研究整理成文，發表在美國的《科學》雜志同年6月刊上。

為獲得研究所用的足量的水母素，從1960年代開始，下村修每年夏天都要帶上家人開車足足七天，橫跨美國到到美國西北海岸的星期五港灣（Friday  Harbor）去大量捕撈多管水母。沒想到，一撈就是19個夏天。過程雖然非常辛苦，但他樂此不疲。糟糕的是，期間發生了一件事，下村等人多年積攢起來的多管水母GFP被“豬隊友“約翰遜帶去參加學術會議時丟失了。而當時的生物技術還不甚發達，做一次GFP結構分析實驗需要上百毫克的GFP。所以，此后數年下村不得不仍舊帶著家人去星期五港灣大量捕撈多管水母。但他沒有氣餒，直到1979年，他才攢足100毫克GFP。推測出了多管水母GFP發光基團的化學結構，并在《歐洲生物化學學會聯盟通訊》上公開了這一研究成果。

如果想繼續進行更深入的理化性質和分子結構研究，則需要在一個夏天抓2.5 噸共50000個發光的小水母！下村修帶著自己的妻子兒女和幾個幫手，整個夏天的早晚都拎著小桶在水邊抓水母�；氐綄嶒炇�，他還要忙著把水母的傘蓋下緣切下來，不厭其煩地分離和分析各種成分。剪切，擠壓，過濾，攪拌，沉淀……圖片來源：https://www.nobelprize.org


上圖：多年后，下村修、錢永健帶領助手及學生到星期五港灣故地重游。
下村修：三排左起第三位，錢永�。憾�排左起第一位。

與錢永健的天才不一樣
下村是一位阿甘型的科學家

52歲的他還只是個博士后，不但沒有什么地位和知名度，似乎也沒有什么特別的天分更不必說多么深遠的眼光。尤其不懂包裝和推銷自己。就是在科學界，他也不是一個什么人物。在公眾的眼里，可能就顯得呆傻有余靈光不足。

如果不給他這個諾貝爾化學獎，這個日裔美國老者可能很快就和曾和他一起發現GFP后默然離世的恩師約翰森一樣，很快被人徹底遺忘掉。昨天，下村修在獲悉自己獲得諾貝爾化學獎后，在美國的家中接受日本媒體采訪時坦陳：“有傳言說是生理學或醫學獎，我本以為得化學獎的可能性為零。昨天幾位日本人獲物理學獎是當之無愧，我獲獎只是偶然的幸運。” 

下村是綠色熒光蛋白的第一個發現者。但他謙遜地把這一成果歸之于一系列“幸運”。

“我一生一共抓了85萬只水母。從大量原材料中榨取一點點物質，這可是最傳統的化學研究�！� MBL（Marine Biological Laboratory at Woods Hole）的新聞發布會上，他說出來的也是盡人皆知的大白話：“如果你發現一個有意思的題目，要一直做下去，直到發現一些東西。如果你碰到困難，想辦法克服。不要沮喪�？茖W研究中總有困難�！彼�在獲獎后舉行的新聞發布會上說，經歷過苦難的人，不會輕易產生畏難情緒。他寄語后進說，年輕人遇到困難時容易產生畏難情緒，但是，一旦發現自己感興趣的課題，應該排除萬難，奮力攀登。

1980年，約翰森退休不久，下村修只有離開普林斯頓，直到這個時候已經52歲的下村修其實還是一個博士后。下村修在1961年33歲時作出了重要發現（1962年發表），到1974年46歲時，全部關鍵實驗完成。在他學術生命的黃金時間里面，他一直只是博士后。

1982年至2001年，他到麻省Woods  Hole海洋生物學研究所（MBL）工作，兼波士頓大學教授。2001年MBL退休后，他在沒有任何資助的情況下，繼續作研究，把家里的地下室作為“光蛋白實驗室”，如今已經是80多歲高齡的耄耋老者，還用家庭地址發表文章。

承前繼后的馬丁·沙爾菲

將GFP表達到其他生物體這項工作，1994年由兩個實驗室獨立進行：美國哥倫比亞大學做線蟲的Marty Chalfie實驗室，和加州大學圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的兩位日裔科學家Inouye和Tsuji。

其中，Chalfie等于1994年在《科學》上發表的文章就被引用了3349次。

1988年，綠色熒光蛋白在一次大會上被偶然提起，在座的哥倫比亞大學教授馬丁·沙爾菲突然聯想：何不讓它走出水母，到其它生物中去發光？一個突發奇想，因為種種原因卻在4年后才在實驗室付諸實施；大腸桿菌被神速地變成了“綠色熒光蛋白生產車間”，產量頗高以至于細胞在日光下就呈綠色。沙爾菲繼續將目光轉向他最喜歡的科研物種——線蟲。這種一毫米長的低等小生物通體透明，全身的900多個細胞清晰可辨。經過沙爾菲的改造，整條蟲僅有的6個觸覺感受細胞開始“生產”綠色熒光蛋白，在紫外光的照耀下，這6個細胞在蠕動的小蟲體內就好像用熒光筆描畫出來了一樣。

GFP家族“照亮了生物學研究的未來”

后來，錢永健等人拓寬了多色的熒光蛋白，先后變出了藍色系列、青色系列、黃色系列、橙色系列的熒光蛋白。

之后的十幾年中，綠色熒光蛋白又被用到了病毒、酵母、小鼠、植物甚至人類等各種生物——它們前所未有地在生命活著的狀態下被涂上了顏色：癌細胞裝載了綠色熒光，就與周圍細胞區別開來，它們擴張領地的腳步一覽無余；小得難以追蹤的HIV病毒被鑲了熒光，它們如何進入細胞、躲在細胞哪個角落、怎樣從細胞中冒出去的種種過程就都被暴露在世人眼前……

研究還可以進入更微觀的層次。一枚細胞中的蛋白成千上萬，不僅長相相似，而且都是“隱身”的，科學家將綠色熒光蛋白專門連在他們喜歡的蛋白上，就像在蛋白后邊拖了一顆燈泡。小燈泡在黑暗的細胞中熠熠發光，看到它們跑來跑去，你就知道蛋白躲在哪里，大約在做什么事情。

委員會成員在評論綠色熒光蛋白的功績時說，它“照亮了生物學研究的未來”，不僅如此，它也擴展了我們視野所及的范圍。

著名生物科學家饒毅評價說“這個領域，最重要的工作顯然是下村修和約翰森做的。錢永健在兩個方面做出了重要的貢獻，如果錢與下村修合得獎也很合理。第三重要的是普瑞舍。他承前啟后，有助于推廣應用下村修的發現�！�

細胞里的彩虹 

盡管有許多成功的例子， 但是野生綠色熒光蛋白畢竟是為水母而非實驗室而設計。它有時候不夠亮，有時候滅得太快，有時候在細胞里扎成一團給細胞造成麻煩，還有時甚至不聽話地把科學家喜歡的蛋白拽到錯誤的地方；更嚴重的是，激發野生綠色熒光蛋白需要用高能量的紫外線，這就使得觀察的過程不可避免地對細胞造成了損害。幸好第三位諾貝爾獎得主錢永健出場了，他是第一位致力于改造綠色熒光蛋白的人。今天，改造工程仍在世界上若干實驗室繼續，但是熒光蛋白的應用范圍已經得到大大拓寬。

除了讓綠色熒光蛋白變得更加完美，錢永健等人還用它做模板，先后變出了藍色系列、青色系列、黃色系列、橙色系列的熒光蛋白。再后來，一些科學家從一種海葵中分離出了紅色，人們親切地將其衍生出的紅粉系列命名為草莓、櫻桃、甜瓜、香蕉、橙子、梅子和覆盆子。至此，熒光蛋白終于能在細胞中畫出一道完整的彩虹。

上圖：用產生不同顏色熒光蛋白的細菌創作的圖畫。來源wiki

一組科學家讓這道彩虹華麗升空。他們用多種顏色的熒光蛋白“標記”了小鼠大腦中上百個細胞。一個個拖著長長神經纖維的神經細胞就像一個個 五顏六色的風箏，整齊排布或者彼此相交�？茖W家們可以看出紅色細胞如何同綠色細胞并行不悖，藍色的又如何和紫色的相互糾纏，他們調侃地將小鼠命名為腦虹——Brainbow（來自英語單詞Rainbow，意為彩虹）；而這只具有彩色大腦的小鼠也讓實驗室外的普通人一睹熒光蛋白的魅力。

綠色熒光蛋白在地球上已存在了一億六千萬年。直到公元一世紀，“發光的水母”才第一次被文字記載。又過了兩千年，神秘的熒光蛋白終于爬出海洋，鉆進了其它動物的細胞。

至今也沒有人知道那些在那不勒斯港隨波徜徉的水母究竟如何享用自然送給它們這個閃耀的禮物，然而它無疑已經深入我們所在的“異域”，并幫助人類照亮了周圍那些本不可見的世界。

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