羅氏NimbleGen序列捕獲技術(shù)實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組定向測序
最近在Nature Protocols雜志上在線發(fā)表的一篇文章1介紹了利用NimbleGen序列捕獲技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組定向測序，用于RNA研究中基因發(fā)現(xiàn)和表達定量。
RNAseq技術(shù)在基因表達研究中得到了廣泛的應(yīng)用，可對表達基因進行無偏見的采樣。相比定量PCR可以對更廣泛的基因同步分析，相比芯片方法RNAseq測序結(jié)果準(zhǔn)確性也更高。然而，真核細胞的表達譜具有轉(zhuǎn)錄本數(shù)量眾多、可變剪切情況復(fù)雜，且表達量高低差異大的特點。RNAseq測序結(jié)果分散在整個基因組中，不同基因測序深度差異顯著，對轉(zhuǎn)錄水平偏低的轉(zhuǎn)錄本往往測序深度不足，為進行特定基因的可變剪切體拼接及定量研究造成阻礙。
而序列捕獲技術(shù)通過寡合苷酸探針雜交，富集研究所感興趣的基因或基因組區(qū)段，實現(xiàn)了定向測序。將此技術(shù)與RNAseq結(jié)合，即對RNAseq的測序文庫先進行序列捕獲實驗富集感興趣的轉(zhuǎn)錄本，再進行測序，實現(xiàn)定向RNAseq或RNA捕獲測序（CaptureSeq）。這一方法可以提高目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的測序深度，進行靈敏的基因發(fā)現(xiàn)、有效的轉(zhuǎn)錄本組裝和準(zhǔn)確的基因表達定量。
文中介紹的實驗步驟主要包括探針設(shè)計、捕獲測序和數(shù)據(jù)分析如轉(zhuǎn)錄本拼接及定量。實驗選用了羅氏NimbleGen探針用于目標(biāo)捕獲。NimbleGen可同時生產(chǎn)2萬種探針，可覆蓋多達200Mb的基因組中的分散區(qū)域或連續(xù)的區(qū)域，可以應(yīng)對復(fù)雜的真核生物轉(zhuǎn)錄組。文章指出，在探針設(shè)計時，僅針對目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的部分序列設(shè)計探針，通過這些探針即可捕獲全長轉(zhuǎn)錄本，也可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本中的新外顯子。當(dāng)需對特定剪切方式的轉(zhuǎn)錄本進行定向研究時，可在探針設(shè)計包括連接兩個外顯子片段的探針，專門捕獲這些異構(gòu)體。
此外，實驗設(shè)計了用于質(zhì)控的探針。質(zhì)控探針包括：1. 非轉(zhuǎn)錄的基因間區(qū)的探針，以排除gDNA污染；2. 其他可能造成實驗室污染如大腸桿菌等的序列捕獲探針，以排除實驗室污染；3. 數(shù)個質(zhì)控基因的探針，可用于進行測序前qPCR富集分析，或用于數(shù)據(jù)分析參數(shù)的測試；4. 針對摻入樣本的ERCC RNA設(shè)計的探針。 ERCC RNA Spike-in standards由92個in vitro轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本組成，表達量跨越一個106的范圍，這一些標(biāo)準(zhǔn)品被摻入到最初的RNA樣品中進行捕獲測序，用于判斷測序量是否充足，以及計算捕獲off-target rate。另外，將各轉(zhuǎn)錄本獲得的測序深度，與ERCC RNA Spike-in standards的測序深度比較，可以推算出樣本中各轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。文章作者指出，這個方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄水平較低的基因的富集，富集率與基因數(shù)量相關(guān)，如1000個隨機選擇的基因預(yù)期55倍富集效率。
圖：定向RNAseq測序（CaptureSeq）實驗流程。摘自：Tim R Mercer et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.2014 doi:10.1038/nprot.2014.058.
5微克的總RNA約可生成250ng cDNA文庫，可將多個樣本的文庫混合后根據(jù)Roche NimbleGen的實驗手冊進行捕獲實驗。混合捕獲的實驗方案可以對大量樣本進行低成本的測序。測序后的分析步驟包括比對、拼接、去除非目標(biāo)序列、新基因（外顯子）發(fā)現(xiàn)、定量等。
通過這一實驗，可以對樣本中特定基因的表達進行研究。該方法既RNASeq相比其他表達譜研究方法的優(yōu)勢，又可以進行有目的性的、多樣本的研究。尤其在對于表達水平中低等的轉(zhuǎn)錄本研究中，可以更好地拼接全長轉(zhuǎn)錄本、發(fā)現(xiàn)新基因以及定量分析。
1. Tim R Mercer, Michael B Clark, Joanna Crawford, Marion E Brunck, Daniel J Gerhardt, Ryan J Taft, Lars K Nielsen, Marcel E Dinger, John S Mattick. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.9, 989–1009 (2014) doi:10.1038/nprot.2014.058.
僅用于科研，不用于診斷。
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