問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導致測序結果移碼）

圖1-1


圖1-2

 

解決方法：將PCR 產物克隆到質粒（如T 載體）中挑單克隆測序，或將PCR 產物進行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序。問題圖2（PCR 產物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）

圖2

 

解決方法：主要原因是PCR 產物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR 產物進行PAGE 純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序，便可解決。

 

問題圖3（測序引物有堿基缺失）

 

測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1 有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴重的峰形重疊。

解決方法：重新合成引物，或將引物進行PAGE 純化（注：好多公司雖然稱提供的引物為PAGE級，但是，嘿嘿……）

2、克隆測序時出現峰形重疊

原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測序用質粒中含有兩種以上插入片段不同的質粒；或是是送測序的菌液污染。
 

解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質粒或送菌液再次測序。

3、樣品有雜合/突變位點

模板中有雜合型突變，也就說模板本身在這個位點出現突變；或者是從基因組中擴增出來的雜合位點。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重疊峰(如圖中箭頭所示)。
 

解決方法：建議將DNA 片段克隆到載體再測序。
 

4、polyA/T 和C/G cluster 導致的套峰和測序信號衰減
 

圖4-1

圖4-2

略（太大無法上傳，刪除部分圖片）

圖4-3

圖4-4

RACE 測序時經常遇到圖4-1 和圖4-4 的情形，解決方法：從另一端測序；但如果這樣的序列出現在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。C/G cluster 在PrV 基因組測序時遇到過。后來還是讓TaKaRa 公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時候卻不得不用它們的產品和服務。

 

5、基因中含有重復序列

可能的原因: 樣品中含有重復序列導致的測序結果和PolyA/T 的結果一樣，會導致Frame 滑動，較短的重復序列會導致測序結果出現移碼；而較長的重復序列會使定序信號衰減。

解決辦法: 反向測序有時能夠順利的通過重復序列區域(但不是一定都能夠)，通過多次的測序結果比對，拼接可以得到全序列結果。