賽捷生物擁有一批優秀的文庫構建專業技術人員,具有豐富的建庫經驗和成熟的實驗方法,在cDNA合成、消化、連接及轉化等方面擁有成熟的技術,采用Clontech公司SMART技術,建成的文庫全長cDNA比例高,可用于大規模基因測序和目的基因的篩選。可以針對動物、植物、微生物等組織和細胞等材料進行文庫構建。本公司可提供全方位的cDNA文庫構建,包括:普通cDNA文庫、全長cDNA文庫、均一化cDNA文庫、差減cDNA文庫。 此外,可提供寡核苷酸文庫、基因組文庫等多種文庫構建服務。
1. cDNA文庫構建
cDNA文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。標準cDNA文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT)作逆轉錄引物,或者用隨機引物,給所合成的cDNA加上適當的連接接頭,連接到適當的載體中獲得文庫。每一個cDNA文庫我們都會為您檢測庫容量,重組率和插入片段的平均大小。
(1)服務流程
1)客戶樣品QC
2)從材料中提取總RNA,分離mRNA
3)以mRNA為模板進行cDNA雙鏈的合成
4)對合成的cDNA雙鏈進行分級純化
5)將分級純化的dscDNA與sfiI酶切的pDNR-Lib載體連接。
6)將重組產物轉化大腸桿菌DH10B感受態細胞
7)初級cDNA文庫的QC
a)檢測庫容量(重組子克隆數目)。
b)每個文庫隨機挑取40個克隆子,PCR方法檢測重組克隆子比例(重組率),檢測平均插入片段大小。
c)每個文庫隨機挑取24個克隆子抽提質粒進行雙向測序,通過序列分析判斷插入片段是否含有全長ORF。
(2)您需要提供
1)注明樣品的種屬(如人,小鼠,大鼠等);若為特殊物種,請注明該組織或細胞中的mRNA是否有polyA尾巴以及5’帽子結構
2)收集樣品后,應將樣品立即置于液氮或者-80℃冰箱中以避免mRNA的降解;運送樣品時使用干冰保持低溫
3)送樣量要求:針對每個文庫,客戶需提供:(1)至少0.5g組織或1 x 108個或至少足夠提取1.0 mg總RNA的細胞;(2)至少1.0 mg的總RNA
(3)我們提供
文庫的甘油菌和分析鑒定書(包括總克隆數CFU的鑒定圖,PCR鑒定圖,測序圖譜)
(4)質量保證
初始基因文庫庫容量 1 × 106pfu 以上,如需擴增,擴增后容量1×109pfu 以上;
插入片段平均長度 1.0~1.5kb( 非常規物種不承諾 ) ;
重組效率大于 90 %(質粒文庫),大于 70%( 噬菌體文庫 );
cDNA 的完整性,讀框完整比例 ≥50% (僅對長度為 3 kb 以下的基因而言)。
2.基因組文庫構建
基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。反映基因組的全部信息,用于基因組物理圖譜的構建,基因組序列分析,基因在染色體上的定位,基因組中基因的結構和組織形式等。我公司利用限制性內切酶或機械隨機剪切的方式消化基因組DNA,并將DNA片段插入特殊載體,構建基因組文庫,并保證庫容量和重組率。
(1)服務流程
1)高分子量基因組DNA的制備
2)基因組文庫的構建過程
a)基因組DNA酶切體系條件的優化
b)基因組DNA酶切反應
c)DNA片段和載體的連接反應
d)電轉化
3)文庫的鑒定:檢測庫容量(重組子克隆總數目);隨機挑取克隆子進行抽質粒,酶切鑒定插入片段大小;插入片段的菌落比例(重組率)
(2)您需要提供
動物的血或細胞、新鮮植物葉片、活體昆蟲或純化好的DNA樣品。
(3)我們提供
文庫(10%甘油菌)以及菌落效價(CFU/ml);隨機抽樣測序結果。
(4)質量保證
1)基因覆蓋度達到10倍以上
2)重組率: >90%
3)文庫庫容量 1 × 106pfu 以上